王南平, 何蘭, 郭休玉，顧其勝

上海市水產研究所加工研究室(上海，200433)

羅非魚皮膠原基生物醫(yī)用材料的制備與表征

王南平, 何蘭, 郭休玉，顧其勝

上海市水產研究所加工研究室(上海，200433)

目的取自羅非魚皮制備符合醫(yī)用級膠原蛋白制品，供人體臨床使用。方法從羅非魚皮中藉分級分離提取純化獲得高純度膠原蛋白樣品，用 SDS-PAGE電泳，FI-IR紅外光譜，ELASA法以及掃描電鏡對該樣品進行全面表征。羅非魚皮中分離獲得的膠原蛋白屬I型，羥脯氨酸含量為10.09%，膠蛋白蛋含量為98.47%，純度在95%以上，其抗原性低于牛膠原蛋白，其玻璃化轉化溫度在26～28 ℃，熱溶解溫度都在42 ℃。結論結果表明，自羅非魚皮制備的膠原蛋白完全符合醫(yī)用級水平，可以安全地用于人體臨床的止血和修復。

膠原蛋白；醫(yī)用材料；修復

0 引言

膠原蛋白是動物體內含量最多且分布最廣的結構性蛋白質[1]，由三條肽鏈組成的三螺旋結構，這些都賦予它很多有用的特性，如：高拉伸強度，生物可降解性、低抗原活性、低刺激性和低細胞毒性以及促進細胞生長的性能[2]，由于這些優(yōu)良的生物學性能使之成為一種重要的天然可降解生物醫(yī)用材料而被人體臨床廣泛應用。

在低等動物和哺乳動物中均廣泛存在膠原蛋白。陸生動物的豬、牛是主要的膠原蛋白來源，同樣，在水生動物中，如魚、軟體動物、環(huán)節(jié)動物、棘皮動物等都含有豐富的多重結構類型的膠原蛋白。魚膠原蛋白主要分布在皮和鱗兩個部分，并主要以I型或I型的亞型結構存在，在魚皮中膠原蛋白含量占粗蛋白含量的80%～90%[3]。

水生動物的膠原蛋白與陸生動物的膠原蛋白在結構成份上的主要區(qū)別是亞基氨基酸含量。水生動物膠原蛋白的亞氨基酸含量低于陸生動物膠原蛋白，這可能是溫度條件的變化所致[4]。由該成分所引起肽鏈交聯(lián)度的變化、熱收縮溫度、玻璃化轉化溫度的變化，相應都會影響膠原蛋白分離技術的實施，膠原的物理和生物學特征的改變。因此開展研究魚皮膠原的分離提取技術研究及其表征的研究，對于推進魚膠原蛋白在生物醫(yī)用材料領域的應用是十分必要的。

1 材料與方法

1.1原料

羅非魚皮(Tilapia)取自廣東湛江遂溪水產養(yǎng)殖場，魚個體450～500 g/條，清洗去鱗取皮，去除附著魚肉和鰭，獲得200 g羅非魚皮，切成2 cm×2 cm小塊，備用。

1.2魚皮前處理

1.2.1 將切成小塊的羅非魚皮，放入0.1 mol/L 的NaOH溶液中，料液比1:10(w/v)連續(xù)攪拌(80 rpm)，水溫控制在4 ℃以下，每隔4 h更換一次堿液，重復4次，再用去離子水反復清洗至pH 6.5～7。

1.2.2 將堿處理后的魚皮放入4%濃度的NaCl溶液中，料液比 1:10(w/v)，連續(xù)攪拌(80 rpm)，水溫控制在4 ℃以下，每隔4 h更換一次鹽液，重復4次，再用去離子水反復清洗，將NaCl清洗干凈。

1.2.3 將鹽洗后的魚皮放入無水乙醇浸泡，料液比1:5，4 h后，更換無水乙醇，再用去離子水將乙醇反復清洗干凈。

1.3酸溶性膠原的分離

將魚皮搗碎放入0.5 mol/L的乙酸溶液中，料液比1:20(w/v)，攪拌(60 rpm)6 h后，用40目紗網過濾，去除殘渣。取濾液用冷凍高速離心機(HITACHI centrifuge CR20B2)離心，4 ℃，8 000 g，20 min。取上清液獲得酸溶性分離膠原ASC(acid-soluble collagen)。

將ASC膠液加入NaOH，將膠液調pH至5.5，再加入0.3%的胃蛋白酶，在4 ℃條件下連續(xù)攪拌48 h，再用NaOH調至pH值6.5，即獲得胃蛋白酶水解膠原PSC(pepsine-soluble collagen)，在PSC溶液里加入NaCl至終端濃度為4%，靜置4 h，然后低溫4 ℃條件下離心10 000 g，30 min，取沉淀的膠原。

1.4膠原的純化

將鹽析膠原加入純水，料液比1:4，攪拌(80 rpm)，將膠原重新溶解，裝入透析袋中透析，透析袋截留分子量為100 KD，透析外液為磷酸鹽緩沖液(85% 1/15 M Na2HPO4，15% 1/15 M KH2PO4，pH 7.5)，在4 ℃條件下透析3天，每12 h換透析外液一次，將經透析純化的膠液用-60 ℃冷凍干燥機凍干。

1.5氨基酸測定

取一定量膠原蛋白樣品,在減壓充氮條件下用6 mol/L HC1 于110 ℃水解24 h。采用Agilent1100高效液相色譜儀對樣品進行檢測。

1.6SDS-PAGE電泳測定

參照Laemmli的電泳方法，將冷凍干燥的膠原蛋白溶于Tris-HCl緩沖液(50 m mol/L, pH 7.4, 25 ℃)，取400 μg/mL的膠原蛋白制品10 μL，加入10 μL 2×SDS樣品緩沖液。配制5%濃縮膠、8%分離膠，每孔加10 μL樣品液。在25 mA下電泳。電泳后考馬斯亮藍染色，脫色后掃描記錄。

1.7FT-IR紅外光譜測定

將一定量干燥的KBr和膠原蛋白凍干品置于瑪瑙研缽中，研磨均勻，成粉末狀，裝樣，手動壓片，取出樣品小心放入樣品室。采用Nicolet-SX-170傅立葉紅外光譜儀對樣品在400～4 000/cm掃描，掃描信號累加200次，分辨率為4/cm。

1.8等電點測定

根據《中國藥典》2010第三部附錄IV等電聚焦電泳法測定膠原蛋白等電點。

1.9變性溫度測定

冷凍干燥的膠原蛋白樣品緊密裝入160 μL DSC測定用鋁盒，另一空鋁盒為對照，DSC掃描溫度范圍10～85 ℃，升溫速率2 ℃/min。

1.10酶聯(lián)免疫法檢測蛋白抗原性

取成年實驗大鼠，按照7.2 mg/kg量進行膠原蛋白腹部注射，培養(yǎng)1周時間，斷尾取血200 μL，自然凝固離心取上清，根據大鼠Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書操作，測定大鼠血清、樣本中I 型膠原蛋白(COL-I)含量。

1.11電鏡

將干燥的膠原蛋白樣品用導電性好的粘合劑粘在金屬樣品臺上，然后放在真空蒸發(fā)器中噴鍍一層50～300 A°厚的金屬膜，用JSM-5610掃描電鏡觀察。

2 結果與討論

2.1羅非魚皮的基本成分

羅非魚皮主要化學成分是：水分67.4%，灰分1.3%(濕基)，蛋白質28.4%(濕基)，脂肪1.1%(濕基)，這些基本成分與葉小燕(2008)所測得的數據基本相似。

2.2羅非魚皮膠原蛋白氨基酸組成

羅非魚皮膠原蛋白氨基酸組成如表1所示，其含量以每1 000個總氨基酸殘基中的殘基數表示。

表1 魚膠原蛋白的氨基酸組成Tab.1 Composition of amino acid in collagen of fish

表1的數據表明，膠原蛋白中不含有色氨酸和胱氨酸，甘氨酸約占氨基酸總量的1/3，符合膠原分子一級結構氨基酸G-X-Y的肽鏈組合特征，甘氨酸含量為33.4%，羥脯氨酸與脯氨酸之比為0.77，并且羥脯氨酸高于羥賴氨酸，具有I型膠原的氨基酸組成特點[1]。

表征膠原純度的氨基酸分析結果表明：羥脯氨酸10.03%≥9% ，色氨酸未檢出，符合醫(yī)用級膠原的技術要求。

羅非魚皮的亞基氨基酸含量為190殘基。由于淡水魚生活的水溫環(huán)境相似，鯉魚皮的亞基氨基酸186[6]結果基本一致。動物之間的亞基氨基酸含量的差異與它們的生活環(huán)境差異有關，特別與棲息地的溫度有關。

2.3SDS-PAGE電泳分析

羅非魚皮膠原蛋白電泳如圖1所示。

圖1 羅非魚皮膠原蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE map of tilapia skin collagen

電泳如圖1所示4條肽鏈，分別為330.30 KD，263.64 KD，118.47 KD與109.64 KD。第一條帶顯示未解螺旋的膠原，即[α1]2[α2]，第二條帶顯示膠原蛋白的二聚體，第三條帶和第四條帶分別是α1、α2肽鏈，α1的分子量略大于α2，α1和α2肽鏈的分子量，與參考文獻[8-9](Huang Y, 2011)一致。

四條帶的純度分別為4.84%、48.37%、35.21%與10.05%，膠原含量為98.47%，符合醫(yī)用材料要求純度大于95%的要求。

2.4傅里葉紅外光譜

羅非魚皮膠原傅里葉變換紅外光譜圖見圖2、圖3。

圖2 羅非魚皮膠原傅里葉變換紅外光譜400～4000波數 Fig.2 FTIR map of tilapia skin collagen (wave 400～4000)

圖3羅非魚皮膠原傅里葉變換紅外光譜1600～1700波數
Fig.3FTIRmapoftilapiaskincollagen(wave1600～1700)

酰胺A波峰數出現在3 416.19cm-1處，顯示N-H伸縮振動，證明氫鍵的存在 。酰胺B波峰數出現在2 932.31cm-1處，表示CH2非對稱性振動，是表述膠原蛋白與其它蛋白的特征。酰胺I波峰數出現在1 656.11cm-1處，表示C-O伸縮振動。 酰胺II波峰數出現在1 553.27cm-1處，表示C-N伸縮振動和N-H彎曲振動。所示結果與(J.H.Muyonga 2004)所報告的結果相似。

因為酰胺I出現在1 600～1 690 cm-1波數帶，其對蛋白質二級結構變化敏感，吸收強大，酰胺I帶為C=O伸縮振動及其與N-H彎曲振動、C-N伸縮振動的結合，酰胺I帶和蛋白質的二級結構緊密相關，可敏銳反應膠原蛋白的二級結構的變化。

圖3應用二階導數譜結合去卷積和曲線擬合處理方法，定量計算出膠原蛋白的二級結構。并且利用已知結構的蛋白質對各個子峰進行歸屬，結果見表2。

表2 羅非魚皮膠原蛋白二級導數擬合圖譜Tab.2 Secondary derivatve fitting map of Tilapia skin collagen

在分離純化魚皮膠原蛋白的工藝過程中，由于溫度波動，化學試劑的影響會使膠原蛋白的三股肽鏈之間的氫鍵減弱，逐漸解螺旋，整個蛋白的無序結構增加[1]。歸屬分析所表征的魚膠原二級結構證明魚膠原和其它動物膠原一樣由[α1]和[α2]肽鏈組成的三維螺旋結構，α、β螺旋，折疊及由3個氨基酸構成一個氫鍵閉合的螺旋環(huán)，并且未發(fā)現混亂結結構，證明合理的分離方法可以保持魚皮膠原結構完整性。

2.5膠原蛋白的變性溫度

由圖4、圖5可以看出，羅非魚皮膠原ASC玻璃轉化溫度(Tg)為26.80 ℃，熱溶解溫度(Tm)為42.98 ℃；PSC玻璃轉化溫度(Tg)為28.20 ℃，熱溶解溫度(Tm)為42.21 ℃。魚膠原蛋白的熱變性溫度多數低于30 ℃，(Senaratne 等, 2006)測定蟾魚皮膠原熱變性溫度為28 ℃。(Kimura Ohno,1987)測定冷水性魚如;阿拉斯加鱈魚皮膠原熱變性溫度為16.8 ℃。而哺乳動物的豬皮膠原變性溫度是37 ℃(Nagai 等, 2008)。也同樣說明熱變性溫度與動物體溫和環(huán)境溫度有關。

圖4 羅非魚皮膠原蛋白ASC DSC實驗結果Fig.4 DSC result of tilapia skin ASC (acid-soluble collagen)

圖5 羅非魚皮膠原蛋白PSC DSC實驗結果Fig.5 DSC result of tilapia skin ASC (pepsine-soluble collagens)

2.6膠原蛋白的等電點

等電點圖譜顯示羅非魚膠原PSC的等電點在6.8～7.01范圍，ASC在6.9～7.03范圍，ASC和PSC膠原等電點的變化估計是由于胃蛋白酶去除膠原端肽而引起的[14]。從膠原氨基酸的酸性和堿性情況分析，也可得出等電點應該呈弱酸性。

圖6 膠原蛋白等電點圖譜 Fig.6 Isoelectric point map of Tilapia skin collagen

2.7魚膠原抗原性

用羅非魚膠原誘導大鼠產生抗體，用酶聯(lián)免疫分析計算得到大鼠血清中Ⅰ型膠原含量，結果見表3。

表3 酶聯(lián)免疫法測大鼠血清中Ⅰ型膠原含量的結果Tab.3 Result of collagen content in rat serum by Elisa

大鼠1型膠原酶聯(lián)免疫分析結果表明，用酶切除膠原蛋白端肽的酶溶性膠原(PSC)，在大鼠血清1型膠原的含量比酸溶性膠原低46.5%。證明膠原端肽是影響機體抗原的重要因素。表3的結果也顯示魚膠原比牛膠原具有更低的抗原性。

2.8電鏡分析

魚皮膠原蛋白掃描電鏡如圖7所示。

圖7 魚皮膠原蛋白掃描電鏡照片Fig.7 SEM picture of Tilapia skin collagen

圖7所顯示的4幅掃描電鏡圖分別為2萬，5萬和10萬倍，右上角圖清楚顯示膠原纖維的明暗交替排列，首尾相隨，平行排列。膠原分子為右手螺旋，3股肽鏈為左螺旋[15]，左上角圖呈現不同層膠原纖維的排列方向。

3 結論

本文從羅非魚皮中經過嚴格的提取和純化工藝，獲得了高純度膠原蛋白樣品，這為制備醫(yī)用級水平的生物醫(yī)用材料奠定了十分重要的工藝基礎。該產品再通過上述全面的表征，進一步了解和掌握了羅非魚皮膠原蛋白作為人體臨床用的醫(yī)療產品所必需具備的特性?，F簡單歸總如下：

(1)羅非魚魚皮膠原蛋白是I型膠原類型，表征的結果顯示未見與其它類型膠原之共存。

(2)形成膠原蛋白3股肽鏈之間穩(wěn)定的螺旋結構主要的作用力是氫鍵，由于羥脯氨酸的羥基參與肽鏈間氫鍵的形成，所以亞基氨基酸的含量影響膠原纖維的強度，水生動物的亞基氨基酸含量低于陸生動物，水生動物的熱變性溫度也要低于陸生動物。

(3) 影響動物亞基氨基酸的主要因素是動物的體溫與動物生長的環(huán)境溫度。水生動物不僅種類多樣性，而且生活環(huán)境多樣性，所以，暖水性魚和冷水性魚的亞基氨基酸也有較大差異。這就提示我們，在選擇水生動物來源十分重要，且后需進一步提升其玻璃化轉化溫度，接近與人體。

(4)魚膠原是能夠滿足生物醫(yī)用材料所要求的各項技術要求，在純度、雜蛋白含量、羥脯氨酸含量與氨基酸成分等方面度均能達到或超過相關技術指標，并且在抗原性和安全性方面均優(yōu)于牛和豬膠原。作為一種新的優(yōu)良的醫(yī)用生物膠原材料，魚膠原蛋白確實值得大家重視與開發(fā)。

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ExtractingandCharacterizingMedicalGradedCollagenBasedBiomaterialUsingTilapiaMossambicaFishSkin

Wang Nanping, He Lan, Guo Xiuyu, Gu Qisheng

Shanghai Fisheries Research Institute Aquatic Prodncts Processing Lab(Shanghai,200433)

ObjectiveExtract medical grade collagen from Tilapia Mossambica fish skin for human clinical use.MethodsHigh purified collagens were obtained from Tilapia Mossambica fish skin through extraction fractionation and purification. SDS-PAGE, FI-IR, ELASA and Electrical Microscopy were used to characterize the extracted collagens.ResultsCollagen extracted from Tilapia Mossambica are type I collagen with purity being higher than 95%. The collagen contains 10.09% hydroxyproline and 98.47% collagen.Results show that antigenicity of the collagen is lower than bovine based collagen. Its glass transition point is at 26-28 ℃ and melting point 42 ℃, respectively.ConclusionFrom the testing results, it can be concluded that collagen extracted from Tilapia Mossambica fish skin meets the requirements of medical grade biomaterial. Collagen based material can be used in human clinical as bleed stop and repair material.

collagen, medical materials, remediation

10.3969/j.issn.1674-1242.2014.03.005

上海市科技興農重點攻關項目滬農科攻字(2012)

第 4-4 號

王南平，教授級高工，主要從事水產品精深加工研究，E-mail：yujiash@hotmail.com

R318.08

A

1674-1242(2014)03-0146-06

2014-06-23)