章 艷，蘇 慧，蘇云明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

蝙蝠葛酚性堿(PAMD)是從北豆根中提取的活性成分.研究證實PAMD具有抗心律失常、抗腦缺血、抗心肌缺血和抗炎鎮(zhèn)痛等[1-3]方面的藥理作用.前期對蝙蝠葛酚性堿抗腫瘤作用進行研究，發(fā)現(xiàn)不同濃度蝙蝠葛酚性堿對SGC-7901細胞的增殖具有明顯抑制作用，抑制作用與濃度呈正相關(guān)[4].本文旨在研究蝙蝠葛酚性堿對胃癌相關(guān)基因的影響，為臨床上胃癌的治療提供理論和實驗依據(jù).

1 實驗材料

1.1 人胃癌細胞株SGC-7901

來源：凱基生物，貨號：KG026.

1.2 實驗藥物

蝙蝠葛酚性堿(PAMD)：由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王棟教授提供.將 PAMD用一定量的DMSO溶解后用PBS定容，配制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的溶液備用.注射用順鉑(DDP)：齊魯醫(yī)藥有限公司；批準文號：國藥準字H20023461；產(chǎn)品批號：WA2A1105005.將 DDP用生理鹽水溶解解配，制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL溶液備用.空白對照組1為等體積PAMD溶劑.空白對照組2為生理鹽水.

1.3 主要試劑

SYBR Premix Ex Taq 試劑盒：大連寶生物工程有限公司；PrimeScript RT試劑盒：大連寶生物工程有限公司；Trizol： Invitrogen公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計及合成：β-actin：上游5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′；下游5′-TGCATCCTGTCGGCAATG-3′，長度為84 bp；COX-2：上游5′-GCTCAGCCATACAGCAAATCC-3′；下游5′-TCCGGGTACAATCGCACTTAT-3′，長度為101 bp.

1.4 主要儀器

HDL型超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Z36HK型臺式高速低溫離心機：德國Hermle公司；iQ5實時熒光PCR儀：美國BIO-RAD公司；MyCyclerPCR儀：美國BIO-RAD公司.

2 實驗方法

2.1 提取總RNA

取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度制成1×105個/mL的單細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中；常規(guī)培養(yǎng)24 h后，更換含有10%藥物的1640培養(yǎng)基，實驗組PAMD終質(zhì)量濃度為20、10、5 μg/mL，陽性對照組DDP為20 μg/mL，空白對照組1為等體積PAMD溶劑，空白對照組2為等體積生理鹽水；培養(yǎng)24 h后用Trizol法提取總RNA.

2.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

按PrimeScript RT試劑盒的組份配制RT-PCR反應(yīng)液: PrimeScript RT Enzyme Mix I：0.5 μL；5×PrimeScript Buffer：2.0 μL；Oligo dT Primer：0.5 μL；Random 6 mers：0.5 μL； ddH2O：4.0 μL；RNA：2.5 μL；總計：10.0 μL.于37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min；再于85 ℃使反轉(zhuǎn)錄酶失活15 s.

2.3 Real-time PCR分析

按SYBR Premix Ex Taq 試劑盒的組份配制Real-time PCR反應(yīng)液：SYBR Premix Ex Taq：12. 5μL；Real-time up：0.5 μL；Real-time down：0.5 μL；ddH2O：10.5 μL；DNA模板：1.0 μL；總計：25.0 μL.95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s 擴增40個循環(huán).記錄樣品Ct值，應(yīng)用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)處理.

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

3 實驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明，PAMD(20)、PAMD (10)、PAMD (5)組同空白1組比較COX-2 mRNA表達明顯降低，且PAMD(20)組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，DDP(20)組與空白2組比較COX-2 mRNA表達也明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.05).結(jié)果見表1，圖1.COX-2 mRNA熒光定量PCR擴增曲線及溶解曲線見圖2、3.

組別 劑量/(mg·kg-1)COX-2mRNA 表達 (2-△△CT)PAMD(20) 20 0.3503±0.2770??PAMD(10) 10 0.6866±0.4114PAMD(5) 5 0.7521±0.3875DDP(20) 20 0.5628±0.3283Δ空白1 等體積1空白2 等體積1

注：**表示PAMD(20)組與空白1組對比P<0.01；Δ表示DDP (20)組與空白2組對比P<0.05

圖1 PAMD對胃癌COX-2 mRNA表達的影響

圖2 COX-2 mRNA Real-time PCR擴增曲線

圖3 COX-2 mRNA Real-time PCR溶解曲線

4 結(jié) 語

COX是催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素的限速酶.正常狀態(tài)下COX-2活性很低，COX-2過度表達與消化系腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān).COX-2能夠促進細胞黏附，抑制細胞凋亡的發(fā)生，誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[5-6].本實驗研究發(fā)現(xiàn)PAMD各劑量組均能下調(diào)胃癌細胞株SGC-7901 COX-2 mRNA的表達，其中高劑量PAMD(20)組下調(diào)COX-2的作用較為明顯，與空白組對比有統(tǒng)計學(xué)差異，且優(yōu)于陽性對照組.推測PAMD抗胃癌的作用機理可能與其抑制COX-2基因表達有關(guān).

參考文獻：

[1] 肖佳音, 蘇云明, 關(guān) 利, 等. PAMD對缺血性腦損傷Bcl-2和Bax基因表達的作用[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2008, 24(1): 16-19.

[2] 韓 華, 于曉瑾, 培 良, 等. 蝙蝠葛酚性堿對“血瘀”模型大鼠全血粘度及腦缺血大鼠腦血流量的影響[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報, 2007, 35(3): 12-13.

[3] 蘇云明, 蘇 慧, 盛 波, 等. 蝙蝠葛酚性堿對實驗性心肌缺血血流動力學(xué)的影響[J]. 中國藥師, 2004, 7(2): 83-85.

[4] 張洪峰, 章 艷, 蘇 慧. 蝙蝠葛酚性堿對胃癌細胞SGC-7901增殖作用的實驗研究[J].實用腫瘤學(xué)雜志, 2013, 27(2): 116-119.

[5] ALI-FEHMI R, MORRIS R T, BANDYOPADHYAY S,etal. Expression of cyclooxygenase-2 in advanced stage ovarian serous carcinoma: correlation with tumor cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, and survival [J].American Journal of Obstetrics and Gynecology, 2005, 192(3): 819 -825.

[6] TATSUGUCHI A, MATSUI K, SHINJI Y,etal. Cyclooxygenase-2 expression correlates with angiogenesis and apoptosis in gastric cancer tissue [J].Human Pathology, 2004, 35(4 ): 488 -495.