張龍崗，楊玲，劉羽清 董學(xué)颯，朱永安，付佩勝 （山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250117）

克氏原螯蝦 （Procambarus clarkii）隸屬螯蝦科原螯蝦屬，是淡水螯蝦的一個(gè)種，俗稱淡水小龍蝦［1］?？耸显r原產(chǎn)于美國(guó)南部和墨西哥北部，20世紀(jì)30年代末由日本引入到中國(guó)?？耸显r肉味鮮美，高蛋白質(zhì)低脂肪，鈣、磷、鐵質(zhì)含量豐富。自1983年中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所戴愛(ài)云研究員首次提倡開(kāi)發(fā)利用淡水螯蝦以來(lái)，克氏原螯蝦已成為我國(guó)重要的水產(chǎn)資源，現(xiàn)已廣泛分布于我國(guó)東部和中部地區(qū)十余個(gè)省市，甚至已成為一些湖泊和溝渠的優(yōu)勢(shì)種群［2］。

Barbaresi等［3］利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記 （RAPD）對(duì)歐洲5個(gè)克氏原螯蝦群體進(jìn)行了遺傳變異分析，結(jié)果顯示5個(gè)群體具有高度的遺傳變異，揭示了引入的克氏原螯蝦群體來(lái)源于不同的地域。Barbaresi等［4］利用線粒體DNA測(cè)序技術(shù)和微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)西歐和北美的12個(gè)克氏原鰲蝦群體進(jìn)行了分析，探明了克氏原螯蝦在西歐的遷移路線。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)克氏原螯蝦的群體遺傳學(xué)研究也已開(kāi)展，Yue等［5］利用mtDNACOI序列和5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)探討了江蘇南京和浙江桐鄉(xiāng)克氏原螯蝦群體的遺傳結(jié)構(gòu)；劉煒［6］利用7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)探討了東部地區(qū)6個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性及各群體間的親緣關(guān)系。王長(zhǎng)忠等［7］利用17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)江下游地區(qū)4個(gè)克氏原螯蝦群體進(jìn)行了遺傳多樣性研究。本研究利用12對(duì)RAPD引物對(duì)山東地區(qū)3個(gè)克氏原螯蝦地理群體的遺傳差異狀況及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了本底調(diào)查，以期為有針對(duì)性地開(kāi)展克氏原螯蝦資源保護(hù)和遺傳育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

克氏原螯蝦野生群體樣本于2012年4～6月分別采自于山東微山湖 （WS）、東平湖 （DP）以及濟(jì)南小清河 （JN），每個(gè)群體樣本數(shù)量均為30尾。

1.2 基因組DNA的提取

取100mg樣品低溫下剪碎并研磨為糊狀，采用生工生物工程 （上海）股份有限公司的UNIQ－10柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，并用1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)純度，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

在生工生物工程 （上海）股份有限公司合成200條隨機(jī)引物，用于PCR擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體積為25μl，反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5μl，25mmol／L 的 MgCl22μl，2.5mmol／L 的 dNTP 2μl，引 物（10μm／L）為1μl，DNA模板1μl，Taq酶 （TaKaRa，5U／μl）0.2μl，其余由滅菌雙蒸水補(bǔ)足至終體積。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán) （94℃1min，36℃1min，72℃1min），72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，凝膠成相系統(tǒng)觀察、照相。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)觀察結(jié)果，記錄清晰、明亮且重復(fù)性好的條帶。將相同遷移距離的條帶看作同一位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)總條帶數(shù)，多態(tài)性條帶數(shù)。根據(jù)RAPD產(chǎn)物的電泳帶型，在相同的遷移率上，出現(xiàn)帶的記為1，沒(méi)有出現(xiàn)帶的記為0。構(gòu)建原始數(shù)據(jù)庫(kù)矩陣，并據(jù)此統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)總數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)比例，采用NTsys－pc 2.02軟件進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離的分析，并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA抽提結(jié)果

經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，可以看出DNA模板比較純凈單一，沒(méi)有雜帶出現(xiàn)，條帶清晰，濃度和純度基本符合RAPD擴(kuò)增要求。

2.2 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

本研究使用200條隨機(jī)引物對(duì)取自濟(jì)南小清河、微山湖和東平湖3個(gè)不同地理群體的30只克氏原螯蝦進(jìn)行RAPD分析。按照條帶清晰且多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、條帶數(shù)量適中的原則，共挑選出12個(gè)隨機(jī)引物 （表1）。12個(gè)隨機(jī)引物共擴(kuò)增出118個(gè)位點(diǎn)（平均每條引物產(chǎn)生8～12個(gè)位點(diǎn)），其片段大小為200～2000bp，其中多態(tài)位點(diǎn)共計(jì)48個(gè) （多態(tài)片段的比例為40.68% ）。

圖1 制備的克氏原螯蝦DNA凝膠成像圖

表1 篩選出的12個(gè)隨機(jī)引物序列及其擴(kuò)增的條帶數(shù)

2.3 群體內(nèi)與群體間的遺傳相似系數(shù)及遺傳距離

通過(guò)統(tǒng)計(jì)各群體30只個(gè)體間共有的RAPDs，計(jì)算得群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。表2表明，群體內(nèi)的遺傳相似系數(shù) （0.9023～0.9411）明顯大于群體間的遺傳相似系數(shù) （0.6845～0.7973），說(shuō)明群體間的遺傳差異要大于群體內(nèi)的遺傳差異。與其他群體相比，微山群體內(nèi)的遺傳變異程度較大，其次是東平群體，濟(jì)南小清河群體內(nèi)的變異度最小。微山湖和東平湖群體間的遺傳相似系數(shù)最高 （0.7973），遺傳距離最小 （0.2027），說(shuō)明這2個(gè)群體的親緣關(guān)系最近。濟(jì)南小清河和微山湖群體間的遺傳相似系數(shù)最小 （0.6845），遺傳距離最高 （0.3155），說(shuō)明2個(gè)群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 群體聚類分析

基于Nei′s遺傳距離對(duì)3個(gè)克氏原螯蝦群體構(gòu)建UPGMA聚類樹(shù) （圖2）。表明，微山湖群體與東平湖群體聚為一支，濟(jì)南小清河群體單獨(dú)聚為一支。

表2 3個(gè)地理群體的遺傳相似系數(shù)及群體間的遺傳距離

3 討論

克氏原螯蝦遺傳多樣性的研究不僅對(duì)于野生物種的遺傳資源的保護(hù)及苗種的選育具有重要的意義［8］，而對(duì)不同地理群體的特性及相互間差異的了解則是遺傳育種的基礎(chǔ)［9］。本研究利用RAPD標(biāo)記技術(shù)研究了山東省克氏原螯蝦3個(gè)地理群體 （微山湖、東平湖、濟(jì)南小清河）的遺傳多樣性，結(jié)果表明，濟(jì)南小清河群體的遺傳多樣性最低，其次是東平湖群體，微山湖群體的遺傳變異最大。本研究沒(méi)有找出區(qū)分克氏原螯蝦3個(gè)地理群體的特征性條帶，很可能是所篩選的引物還不足以找出這樣的特征帶，對(duì)此還有必要進(jìn)一步探討。

遺傳相似系數(shù)是衡量群體遺傳變異程度的可靠參數(shù)，群體間的親緣關(guān)系越近則遺傳變異性就越低，相似系數(shù)值就越大［10］。濟(jì)南小清河群體內(nèi)的遺傳相似系數(shù) （0.9411）要高于微山湖 （0.9023）和東平湖群體 （0.9325），說(shuō)明其群體內(nèi)個(gè)體間的差異較小，純度較高，遺傳多樣性偏低，也反映出近年來(lái)濟(jì)南小清河群體因酷漁濫捕對(duì)其群體資源的影響較大，造成其群體內(nèi)多態(tài)性有所下降，可利用的遺傳變異減少。

遺傳距離是反映群體遺傳變異程度的尺度，常常用來(lái)分析群體間的親緣關(guān)系和遺傳變異程度，遺傳距離越大表明群體間親緣關(guān)系就越遠(yuǎn)。濟(jì)南小清河和微山湖群體間的遺傳距離最高 （0.3155），說(shuō)明2個(gè)群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；贜ei′s遺傳距離對(duì)3個(gè)克氏原螯蝦群體構(gòu)建的UPGMA聚類樹(shù)也表明，微山湖群體與東平湖群體親緣關(guān)系較近，與濟(jì)南小清河群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分析可能是因?yàn)殡S著近年來(lái)小龍蝦產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，尤其微山湖和東平湖一帶小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較快，每年都有大量來(lái)自長(zhǎng)江流域的小龍蝦苗種引入，人為因素的介入使得微山湖群體與東平湖群體與外界存在著頻繁的基因交流。而濟(jì)南小清河群體環(huán)境相對(duì)封閉，與其他群體缺乏基因交流，與其他群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而獨(dú)立成組。

目前，對(duì)于克氏原螯蝦功能基因方面的信息了解還不多，下一步需對(duì)克氏原螯蝦多態(tài)性序列進(jìn)行大批量的測(cè)序分析，最終將其定位在某條染色體或某個(gè)功能基因上，通過(guò)基因工程的方法，培育出具有優(yōu)良性狀的品種，以促進(jìn)克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展。

圖2 UPGMA聚類分析法構(gòu)建的3個(gè)群體克氏原螯蝦的分子系統(tǒng)樹(shù)

［1］沈嘉瑞.我國(guó)的蝦類 ［M］.北京：科學(xué)出版社，1976.

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