顧夙，徐守宇

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院骨科，河南南陽473000；2.浙江中醫(yī)藥學(xué)院附屬第三臨床醫(yī)學(xué)院骨科，浙江杭州310053）

白花蛇舌草對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的保護(hù)作用

顧夙1，徐守宇2

（1.河南省南陽市中心醫(yī)院骨科，河南南陽473000；2.浙江中醫(yī)藥學(xué)院附屬第三臨床醫(yī)學(xué)院骨科，浙江杭州310053）

目的探討白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.，HD）對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠（collagen-induced arthritis，CIA）的保護(hù)作用。方法60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組（n＝10）和給藥組（n＝50），給藥組用于建立Wistar大鼠CIA模型，造模成功后再隨機(jī)分為模型組，雷公藤組，白花蛇舌草低、中、高劑量組，每組各9只并給予相應(yīng)藥物處理。自造模后第14天開始，每周觀察各給藥組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，于第42天處死大鼠檢測(cè)各組血清的IL-1β、TNF-α水平，對(duì)比各組大鼠滑膜組織膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達(dá)情況。結(jié)果HD低劑量組在第35天及42天時(shí)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著低于模型組（P＜0.05）；HD高劑量組在第28、35及42天時(shí)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05）；HD各劑量組、IL-1β、TNF-α水平均顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；HD各劑量組膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達(dá)量顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論HD可降低細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平，緩解膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)及骨質(zhì)侵蝕，提示HD對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)具有保護(hù)作用。

白花蛇舌草；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；大鼠；保護(hù)作用

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性、全身性自身免疫疾病［1］，研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與遺傳因素、感染因素、免疫因素、內(nèi)分泌因素等相關(guān)［2-3］。目前，RA尚無根治的方法，傳統(tǒng)西醫(yī)治療RA藥物有4大類：非甾體抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）、改善病情抗風(fēng)濕藥（disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）、糖皮質(zhì)激素和生物制劑（如TNF-α抑制劑等）［4-5］。上述藥物主要改善癥狀、緩解病情，因不能根治疾病，并且有嚴(yán)重的胃腸道、肝腎功能損害等不良反應(yīng)，難以推廣使用。我國(guó)民間應(yīng)用中藥組方（如益氣解毒化瘀湯、痹腫消湯等）對(duì)RA的治療已有悠久的歷史?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明組方中單味中藥白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld.，HD）具有與治療RA相關(guān)的抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等作用［6］。為進(jìn)一步探討清熱解毒藥物白花蛇舌草對(duì)RA的治療機(jī)理，本研究采用膠原誘導(dǎo)制作關(guān)節(jié)炎性Wistar大鼠模型（collagen-induced arthritis，CIA），觀察HD抗風(fēng)濕的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SPF級(jí)Wistar大鼠60只，體質(zhì)量為（200±10）g，8周齡，購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK（蒙）2012-0001。本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：完全弗氏佐劑（美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)070M8704）；不完全弗氏佐劑（美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)050M873）；牛II型膠原（美國(guó)Chondrex公司，批號(hào)110374、120197）；白花蛇舌草片（天津市中藥飲片廠，國(guó)藥準(zhǔn)字Z36020632）；雷公藤多甙片（黃石飛云制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z42021212）；大鼠TNF-αELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)G26030370）；大鼠IL-1βELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)G12030371）；β-actin（TA-09，北京中杉金橋公司）；全蛋白提取試劑盒（BSP003，上海生工生物工程有限責(zé)任公司）；Rabbit Anti-AnnexinⅠ（Abcam）；IRDye 800cw Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）（美國(guó)LICOR公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)LICOR公司）；TE77XP半干電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（賽默飛世爾上海儀器有限公司）；1730R高速低溫離心機(jī)（基因有限公司）；Multiskan Mk3酶標(biāo)儀（PE公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組：60只雄性Wistar大鼠，購(gòu)回適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按隨機(jī)數(shù)字表法從60只大鼠中分出10只作為正常組，余下50只為給藥組，用于進(jìn)行CIA模型的復(fù)制。

1.2.2 CIA大鼠模型的建立：按Chondrex公司膠原誘導(dǎo)性（CIA）大鼠模型制備的說明書進(jìn)行，具體方法：先將牛Ⅱ型膠原10 mg完全溶合于0.05 mol／L乙酸水5mL中，配制成2mg／mL的牛Ⅱ型膠原溶液，再將5 mL此溶液與5 mL完全弗氏佐劑（Freund's complete adjuvant，F(xiàn)CA）充分混勻，配制成1mg／mL的牛Ⅱ型膠原溶液，模型組每只大鼠尾根部皮下注射抗原0.2mL；于7 d后用5mL牛Ⅱ型膠原與5mL不完全弗氏佐劑（Freund's incomplete adjuvant，IFA）用同樣方法配制成1 mg／mL牛Ⅱ型膠原溶液，以每只0.1mL于大鼠尾根部皮下注射再次免疫。正常組注射同樣劑量的生理鹽水。在初次免疫2周后，對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行全面評(píng)估，剔除模型復(fù)制不成功動(dòng)物。成功復(fù)制的CIA模型大鼠45只，造模成功率為90%。把造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、雷公藤組、HD低劑量組、HD中劑量組及HD高劑量組，每組各9只。

1.2.3 白花蛇舌草劑量的確定：根據(jù)體表面積折算的等效劑量比值（詳見《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》）［7］，70 kg成人，每天服用白花蛇舌草30 g，相當(dāng)于大鼠灌胃6 g／（kg·d），再取該劑量的相差1倍的相鄰劑量，即確定3個(gè)干預(yù)劑量3 g／（kg·d）、6 g／（kg·d）、12 g／（kg·d）。

1.2.4 給藥方法：于注射免疫14 d后，正常組及模型組給予蒸餾水灌胃1mL／（只·天），雷公藤組給予6.3 mg／（kg·d）雷公藤，HD低、中、高3個(gè)治療組灌服白花蛇舌草片，灌胃劑量分別：3 g／（kg·d）、6 g／（kg·d）、12 g／（kg·d），1次／天，時(shí)間固定在上午9∶00，連續(xù)灌胃42 d。

1.2.5 觀察指標(biāo)

①一般情況觀察：精神狀態(tài)、被毛、食欲和活動(dòng)情況，大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)變化。

②關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）測(cè)定：自造模后第14天開始給大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病情況計(jì)分。該積分法主要內(nèi)容為5級(jí)積分。其中，無關(guān)節(jié)炎現(xiàn)象記0分；小拇趾關(guān)節(jié)部位出現(xiàn)紅熱腫痛現(xiàn)象記1分；趾關(guān)節(jié)和足跖部出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象記2分；踝關(guān)節(jié)以下部位出現(xiàn)紅腫脹痛記3分；踝關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)以下部位出現(xiàn)紅腫脹痛者4分。最后積分為四肢關(guān)節(jié)評(píng)分總分之和［8］。

③血清IL-1β及TNF-α水平測(cè)定：實(shí)驗(yàn)至42d時(shí)，各組大鼠禁食12h后斷頭取血，離心取上清液，按ELISA試劑盒說明書步驟，檢測(cè)各組血清中IL-1β及TNF-α水平。

④ 膜聯(lián)蛋白Ⅰ表達(dá)檢測(cè)：取已處死大鼠的滑膜組織，Westernblot法檢測(cè)膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達(dá)情況。方法如下：抽提滑膜蛋白，測(cè)濃度，每孔上樣量50μg，10%SDS-PAGE電泳，電壓100 V；轉(zhuǎn)膜，電流18mA，時(shí)間40min；一抗?jié)舛?∶500，4℃搖床孵育過夜；二抗?jié)舛?∶5000，室溫避光搖床孵育1 h；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（Odyssey）成像，運(yùn)用儀器自帶軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)計(jì)量資料以“±s”表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各給藥組大鼠AI變化情況 HD低劑量組在第35天及42天時(shí)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著低于模型組（P＜0.05）；HD高劑量組在第28、35及42天時(shí)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05，見表1）。

表1 各給藥組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）比較（分）Tab.1 Comparison of the arthritic index in each drug groups（score）

2.2 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比較 42 d時(shí)，模型組、HD各劑量組IL-1β、TNF-α水平顯著高于正常組（P＜0.05）；高、中、低劑量組IL-1β、TNF-α水平顯著低于模型組（P＜0.05）；其中高劑量組的降低程度顯著優(yōu)于中、低劑量組（P＜0.05，見表2）。

表2 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比較（pg／mL）Tab.2 Comparison of the levels of IL-1βand TNF-αin each groups（pg／mL）

2.3 各組大鼠滑膜組織膜聯(lián)蛋白Ⅰ的灰度值比較 42 d時(shí)，HD各劑量組膜聯(lián)蛋白Ⅰ的灰度值顯著低于模型組 （P＜0.05，見表3）。

表3 各組大鼠滑膜組織膜聯(lián)蛋白Ⅰ的灰度值比較Tab.3 Comparison of the gray value of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in each groups

3 討論

白花蛇舌草為痹腫消湯中的君藥之一，是臨床上常用清熱解毒藥。其藥理活性、化學(xué)成分及質(zhì)量控制等方面的研究已有文獻(xiàn)基礎(chǔ)［9］：白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、保肝利膽等生物活性；化合物組成包括黃酮類、葸醌類、萜類、甾醇類、多糖類和酚酸類等。

目前，已有白花蛇舌草治療RA相關(guān)機(jī)制的研究，主要通過調(diào)節(jié)免疫，下調(diào)炎癥因子水平，抑制血管新生等方面起作用。張良等［10］研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草對(duì)RA患者體外滑膜細(xì)胞的增殖有抑制作用。王瑞等［6］研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草能通過抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）緩解膠原誘導(dǎo)性（CIA）大鼠癥狀、控制炎癥。顧士棟等［11］研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草能夠清除氧化損傷后細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧（ROS），而減輕荷瘤小鼠正常器官氧化損傷。

本研究根據(jù)Trentham等［15］提出的Ⅱ型膠原可產(chǎn)生抗原效應(yīng)而造成組織免疫性損傷理論，應(yīng)用Ⅱ型膠原建立大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型。該模型特征與人類RA非常相似，是目前國(guó)內(nèi)外研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最優(yōu)選的動(dòng)物模型。研究結(jié)果顯示，CIA大鼠經(jīng)HD治療28d后飲食、活動(dòng)有所增強(qiáng)，毛發(fā)較模型組有光澤，關(guān)節(jié)炎指數(shù)與模型組比較有明顯差異；血清中IL-1β、TNF-α含量，較模型組明顯下降，且具有一定的劑量依賴性，說明HD可減輕CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，降低炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的水平?？赡茉蛟谟诎谆ㄉ呱嗖萃ㄟ^下調(diào)IL-1β、TNF-α水平，抑制黏附分子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其他炎癥因子的產(chǎn)生，促進(jìn)骨膠原合成，減少金屬蛋白酶的表達(dá)及活性，而起到減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)、骨質(zhì)侵蝕和減少血管翳形成的作用［12-16］。這與王瑞等［6］研究結(jié)果相一致。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，HD各劑量組膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達(dá)水平明顯高于正常組與模型組，說明白花蛇舌草可明顯上調(diào)膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達(dá)?？赡茉蛟谟谀ぢ?lián)蛋白Ⅰ作為抗炎反應(yīng)的調(diào)控因子，在HD的作用下，其生成量增多，直接占據(jù)嗜中性粒細(xì)胞表面受體或抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素和血漿腫瘤壞死因子，進(jìn)而抑制炎癥細(xì)胞黏附、滲出及浸潤(rùn)［17-19］。

綜上所述，HD可降低細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平，緩解膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)，提示HD對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)具有保護(hù)作用。但是由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性使得中藥難以向世界推廣，得到國(guó)際認(rèn)可，因此未來提取HD中單一有效成分進(jìn)行研究是必要的。同時(shí)這些提取的化學(xué)成分，是否為HD口服后在體內(nèi)可吸收成分，是否為HD治療RA療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，需要利用生物藥理分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究來探究。

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（編校：王冬梅，吳茜）

Protective effect of Hedyotis diffusa Willd.on collagen-induced arthritismodel rat

GU Su1，XU Shou-yu2

（1.Department of Orthopaedic，Nanyang Municipal Central Hospital，Nanyang 473000，China；2.Department of Orthopaedic，The Third Affiliated Clinical Medical School of Zhejiang Traditional Chinese Medicine College，Hangzhou 310053，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of Hedyotis diffusa Willd.on collagen-induced arthritis ratmodel.Methods60 maleWistar ratswere randomly divided into normal controlgroup（n＝10）and drug group（n＝50），the drug group were used to induced CIAmodel ofWistar rats，then were random ly divided into CIAmodel group，tripterygium group，low-dose HD group，medium-dose HD group，high-dose HD group，with 9 rats in each group，and were treated with homologous drugs.Since the14th day after induced，the arthritic index of all rats atdifferent time pointswere observed and measured.At42th day，all ratswere killed tomeasure the changes of serum cytokine levels including IL-1β，TNF-αlevel，and the gray value of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in each group were compared.ResultsThe arthritic index，in HD low dose group at 35thand 42th day were significantly lower than that inmodel group，and in HD high dose group at28th，35thand 42th day were significantly lower than those in model group，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.The levels of IL-1βand TNF-αin all HD dose groups were significantly lower than that in model group，and the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.The expression of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in all HD dose groups were significantly higher than that inmodel group，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.ConclusionHD could reduce the levels of cytokines（IL-1β，TNF-α），and alleviate the inflammatory response and bone erosion in CIA model.It is suggested that Hedyotis diffusa Willd.has the protective effect on collagen-induced arthritis rat.

Hedyotis diffusa Willd；collagen-induced arthritis；rat；protective effect

R32

A

1005－1678（2014）09－0064－04

2011年浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃（2011KYA116）

顧夙，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：骨關(guān)節(jié)，E-mail：qch1821460065＠163.com。