郭麗蓉，孫常青

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部保健科，福建廈門361000）

鹽酸曲美他嗪對心肌缺血再灌注大鼠Fas、FasL基因表達(dá)的影響

郭麗蓉，孫常青

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部保健科，福建廈門361000）

目的通過對心肌缺血再灌注模型大鼠應(yīng)用鹽酸曲美他嗪，探究其對心肌細(xì)胞Fas、FasL基因表達(dá)情況的影響。方法選取44只成年健康雄性大鼠，采取隨機(jī)數(shù)表法分組，正常組11只，不予任何藥物及手術(shù)治療，模型組11只，建立心肌缺血再灌注模型，實(shí)驗(yàn)組及對照組各11只，在模型組基礎(chǔ)上于缺血前5min分別注射鹽酸曲美他嗪10mg、1%磷酸鹽緩沖液300 UI，試驗(yàn)后各組通過缺口末端標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞凋亡水平，并通過PCR逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測Fas、FasL基因表達(dá)水平。結(jié)果大鼠心肌區(qū)形態(tài)變化提示鹽酸曲美他嗪處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷能產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。免疫組化分析顯示對照組心肌間質(zhì)只有散在染色極淺的弱陽性反應(yīng)。模型組與對照組Fas、FasL表達(dá)較明顯，與實(shí)驗(yàn)組比較，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)較低。實(shí)驗(yàn)組與對照組均有不同程度壞死基因表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)組Fas表達(dá)（0.23±0.17）、FasL表達(dá)（0.21±0.09）、壞死面積（23.41±5.37）與對照組Fas表達(dá)（0.59±0.16）、FasL表達(dá)（0.51±0.04）、壞死面積（41.66±4.19）比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與對照組心肌組織電泳結(jié)果均不同程度表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組較對照組Fas／FasLmRNA的水平明顯降低。結(jié)論鹽酸曲美他嗪能夠明顯降低心肌細(xì)胞缺血后再灌注的凋亡損傷水平，并通過抑制Fas、FasL基因的表達(dá)，減緩心肌再灌注損傷，對心肌缺血疾病治療具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

鹽酸曲美他嗪；心肌缺血；再灌注；凋亡；FasL

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury） 是由于多種復(fù)雜因素的心肌細(xì)胞缺血一定時(shí)間后，血流供應(yīng)恢復(fù)，造成肌細(xì)胞再灌注時(shí)凋亡增高的一類疾?。?］。主要因缺血后再灌注，導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞內(nèi)外鈣離子水平失衡，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度超標(biāo)200倍左右，加重心腦、肝腎等器官血管急劇收縮，加重血液供應(yīng)障礙［2］。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，我國每年心肌缺血再灌注損傷患者發(fā)病率從1999年的18.23%上升至2010年的32.78%，并有逐年上升趨勢［3］。隨著再灌注損傷治療治療技術(shù)的發(fā)展，人們更加重視疾病的早期診斷及預(yù)后［4］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取控制血氧及擴(kuò)血管等方法來保護(hù)并回復(fù)心肌細(xì)胞的缺血狀態(tài)，但由于多數(shù)肌細(xì)胞損傷較重并不可逆，但臨床效果并不理想［5］。研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸鹽酸曲美他嗪能抑制細(xì)胞凋亡水平，對心肌缺血起到保護(hù)性作用，降低凋亡基因Fas、FasL的表達(dá)來減輕缺血再灌注的損傷程度，最終提高臨床療效并減低死亡率。筆者做了大量研究，通過觀察心肌細(xì)胞凋亡及Fas、FasL基因表達(dá)水平，來探究鹽酸鹽酸曲美他嗪對心肌缺血再灌注大鼠心肌受損情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取44只4周齡健康雄性大鼠（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為2001A032），采取隨機(jī)數(shù)表法分組，正常組11只，平均體質(zhì)量（275.2±27.1）g，模型組11只，平均體質(zhì)量（284.2±25.4）g，對照組11只，平均體質(zhì)量（293.2±19.2）g，試驗(yàn)組11只，平均體質(zhì)量（288.3±24.9）g。依據(jù)遵循中國科學(xué)技術(shù)委員會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量、鼠齡、飼養(yǎng)方式、無顯著性差異。

1.1.2 試驗(yàn)藥物及試劑：鹽酸曲美他嗪（LES LABORATOIRESSERVIER有限公司，注冊號(hào)：H20120477），細(xì)胞凋亡水平檢測試劑（Promega公司），RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑（北京中杉生物公司）。Taq DNA擴(kuò)增聚合酶、Buffer、dNTPs試劑（TAKARA公司），PCR引物（上海生工），DulbeccocsPBS（DPBS）、蛋白酶K（Sigma公司）；Fas免疫組化SABC染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與給藥：選取44只成年健康雄性大鼠，通并采取隨機(jī)數(shù)表法分組，正常組11只，不予任何藥物及手術(shù)治療；模型組11只，通過大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支2mm處應(yīng)用0號(hào)絲線結(jié)扎，造成心肌缺血，并應(yīng)用心電圖監(jiān)測心肌缺血變化，當(dāng)扎緊絲線后心電圖I導(dǎo)聯(lián)或左前胸導(dǎo)聯(lián)融合的ST-T抬高，松解絲線后抬高的ST-T下降1／3以上為模型成功。在術(shù)后45 min松解結(jié)扎線制造再灌注損傷，實(shí)驗(yàn)組及對照組各11只，在模型組基礎(chǔ)上術(shù)前5min于大鼠陰莖背靜脈分別注射鹽酸曲美他嗪10mg、1%磷酸鹽緩沖液300 UI。

1.2.2 指標(biāo)檢測：各組均在試驗(yàn)后6 h通過缺口末端標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞凋亡水平，具體步驟如下：取大鼠心肌組織打碎并制造勻漿，加入DPBS試劑7mL，在冰浴中進(jìn)行勻漿并凍融3次，在5000 r／min離心機(jī)中離心30min，取上清液，放置于離心管中以15000 r／min二次離心2 h，沉淀物加用50μL氯化鉀及Tris-HCL、Nonident試劑，進(jìn)行懸浮試驗(yàn)，100℃沸水浴10 min，最后1000 r／min離心5min，取上清液3μL放入PCR儀器中檢測，同時(shí)取正常組及模型組大鼠心肌組織做對照性試驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組大鼠左室活體灌注含肝素的生理鹽水后，再灌注4%多聚甲醛以預(yù)固定心肌細(xì)胞組織，解剖并取出心臟繼續(xù)固定24 h，應(yīng)用常規(guī)石蠟包埋心臟標(biāo)本，于心肌梗死區(qū)中部沿左室軸線每隔1mm連續(xù)切取數(shù)張5μm切片，并進(jìn)行HE染色心肌細(xì)胞組織，通過顯微鏡觀察標(biāo)本凋亡水平。

心肌細(xì)胞凋亡水平分析：取各組試驗(yàn)結(jié)束前心肌組織，PBS沖洗組織，－20°冰凍10 min，TTC染色，1 mm切片，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)分析并測定壞死面積。后取各組試驗(yàn)后大鼠心肌細(xì)胞，行切片后，HE染色，以顯微鏡檢測組織損傷情況。

采用PCR法檢測心肌組織中的FasL及Fas的mRNA表達(dá)水平：根據(jù)Hiroo Nakajima等［17］設(shè)計(jì)的Fas／FasL特異性引物序列合成引物（由上海捷瑞生物工程技術(shù)有限公司合成），擴(kuò)增片段長度、引物序列、PCR反應(yīng)條件等見表1：

表1 PCR引物、擴(kuò)增片段長度、引物序列、反應(yīng)條件Tab.1 PCR primers，amplified fragment length，primer sequence，reaction conditions

提取總RNA并行單管RT-PCR反應(yīng)，做凝膠電泳及攝影分析。用IBAS圖像分析儀對PCR雜交結(jié)果進(jìn)行光密度掃描，測得FasL、Fas條帶與GAPDH條帶的峰面積積分。

免疫組化法檢測心肌Fas／Fasl蛋白表達(dá)：取上述石蠟標(biāo)本相應(yīng)部位的連續(xù)切片各1張，免疫組化觀察心肌組織Fas蛋白的表達(dá)，具體方法如下所述：石蠟切片脫臘和水化；PBS沖洗，5 min× 2次；用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗3次；微波熱修復(fù)抗原（1∶500）：將切片浸入0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH＝6.0），微波爐里加熱至沸騰后斷電，間隔5～10min后，反復(fù)1～2次。冷卻后PBS洗滌1～2次；滴加5%BSA封閉液，室溫20 min。甩去多于液體，不洗；置濕盒4℃孵育過夜；在37℃復(fù)溫45min，PBS沖洗，2 min×3次；每張切片滴加生物素化二抗（1∶200），20℃～37℃20min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑SABC，20℃～37℃20 min，PBS沖洗，5 min×4次；DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取1m l蒸餾水，加A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在1～5min之間；自來水充分沖洗，終止反應(yīng)；蘇木素輕度復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán)；DAB染色切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌區(qū)形態(tài)變化比較 正常組心肌結(jié)構(gòu)完整，可見散在的炎性細(xì)胞，模型組可見心肌肌纖維結(jié)構(gòu)混亂，充斥大量炎性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組可見心肌細(xì)胞恢復(fù)較好，偶見炎癥因子，結(jié)構(gòu)類似于正常組織，對照組則恢復(fù)較差，肌纖維結(jié)構(gòu)混亂，與模型組類似（見圖1）。

圖1 各組心肌組織HE染色結(jié)果（×400）Fig.1 HE staining results ofmyocardial tissue（×400）

2.2 Fas、FasL基因免疫組化結(jié)果 免疫組化分析顯示對照組心肌間質(zhì)只有散在染色極淺的弱陽性反應(yīng)。Fas、FasL基因免疫組化結(jié)果基本一致，故本文以Fas基因免疫組化結(jié)果為例，進(jìn)行探討。模型組與對照組Fas表達(dá)較明顯，與實(shí)驗(yàn)組比較，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)較低，見圖2。

圖2 Fas基因免疫組化結(jié)果（×400）Fig.2 Immunohistochemistry results of Fas gene（×400）

2.3 各組Fas、FasLmRNA表達(dá)水平及PCR試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組均有不同程度的Fas、FasL基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平，與正常組水平相似，顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組壞死面積均有不同程度的減少，實(shí)驗(yàn)組壞死面積與正常組水平相似，顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表2 各組Fas、FasL基因表達(dá)情況比較Tab.2 Comparison of the expression of Fas，F(xiàn)asL gene

3 討論

心肌細(xì)胞缺血壞死是最常見的心臟系統(tǒng)疾病，由于藥物、創(chuàng)傷、精神、血流動(dòng)力學(xué)改變等因素，導(dǎo)致心肌供血不足，局部組織缺血，當(dāng)血液供應(yīng)恢復(fù)，造成再灌注性損傷，加重肌細(xì)胞凋亡［6-8］。主要表現(xiàn)為心慌、心悸，胸中痹痛，面色蒼白等癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)心肌梗死等危重病癥［9-10］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近20年心肌缺血性疾病發(fā)病率從11.33%上升到42.12%，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量［11］。其中5.72%～15.63%的人群可出現(xiàn)心肌梗死等缺血性再灌注損傷表現(xiàn)［12-13］。且目前臨床治療再灌注損傷主要以恢復(fù)血氧及供血水平，及應(yīng)用心臟支架、搭橋等手術(shù)來根治，但由于術(shù)后心肌再梗死情況仍會(huì)發(fā)生，嚴(yán)重影響預(yù)后［14-15］。目前臨床上可應(yīng)用心肌保護(hù)性方案，預(yù)防心肌缺血后再灌注的損傷情況，主要通過平衡肌細(xì)胞內(nèi)鈣水平，減輕動(dòng)脈平滑肌痙攣，并可降低Fsa、FsaL等凋亡基因在體內(nèi)的表達(dá)情況，從而改善再灌注損傷［16］。筆者為此做了相關(guān)研究，主要通過觀察心肌細(xì)胞凋亡及Fas、FasL基因表達(dá)水平，來探究鹽酸曲美他嗪對心肌缺血再灌注大鼠心肌受損情況。

研究發(fā)現(xiàn)，正常組心肌結(jié)構(gòu)完整，可見散在的炎性細(xì)胞，模型組可見心肌肌纖維結(jié)構(gòu)混亂，充斥大量炎性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組可見心肌細(xì)胞恢復(fù)較好，偶見炎癥因子，結(jié)構(gòu)類似于正常組織，對照組則恢復(fù)較差，肌纖維結(jié)構(gòu)混亂，與模型組類似。提示示鹽酸曲美他嗪處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷能產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。而免疫組化分析顯示對照組心肌間質(zhì)只有散在染色極淺的弱陽性反應(yīng)。模型組與對照組Fas、FasL表達(dá)較明顯，與實(shí)驗(yàn)組比較，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)較低。各組Fas、FasL基因表達(dá)水平及壞死面積比較：試驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)組與對照組均有不同程度壞死基因表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)組Fas表達(dá)（0.23±0.17）、FasL表達(dá)（0.21±0.09）、壞死面積（23.41±5.37）與對照組Fas表達(dá)（0.59±0.16）、FasL表達(dá)（0.51±0.04）、壞死面積（41.66±4.19）比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），心肌細(xì)胞凋亡壞死后會(huì)導(dǎo)致大量Fas、FasL基因mRNA表達(dá)，其是一種腫瘤壞死因子，在心肌組織凋亡壞死時(shí)產(chǎn)生，并誘發(fā)加重壞死程度，鹽酸曲美他嗪可明顯降低凋亡基因表達(dá)，改善再灌注時(shí)損傷加重狀態(tài)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞，改善臨床療效。

綜上所述，鹽酸曲美他嗪可明顯抑制肌細(xì)胞缺血后Fas、FasL基因的表達(dá)，對肌細(xì)胞形成較好保護(hù)，并維持細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度，降低動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞痙攣水平，改善心臟供血，最大程度降低再灌注損傷情況，對心肌缺血疾病治療具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

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（編校：譚玲，王儼儼）

Effect of trimetazidine hydrochloride on Fas，F(xiàn)asL gene expression of myocardial ischem ia and reperfusion rats

GUO Li-rong，SUN Chang-qing

（Department of Cardre's Health Care，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361000）

ObjectiveTo investigate the effectof trimetazidine hydrochloride on Fas，F(xiàn)asL gene expression ofmyocardial ischemia and reperfusion rats.Methods44 healthy adultmale ratswere selected and divided into four groups according to a random number tablemethod：11 rats in the normal group treated without any drugs and surgery；11 rats in model group ofmyocardial ischemia and reperfusion；11 rats in experimental group injected with trimetazidine hydrochloride and 11 rats in control group injected with 1%phosphate buffer on the basis ofmodel group treatment5min before ischemia. Myocardial apoptosis levels were detected by nick end labeling，and Fas，F(xiàn)asL gene expression levels were detected by PCR reverse transcription polymerase chain reaction.ResultsMorphological changes of ratmyocardial region suggest QuMei hydrochloride trimetazidine treatment on myocardial ischemia reperfusion injury in rats can produce a protective effect.Immunohistochemical analysis showed that the control group myocardial interstitial only scattered in the extremely shallow weak positive staining reaction.The model group and the control group Fas，F(xiàn)asL expression significantly，compared with the experimental group，the experimental group had low expression.The experimental group and the control group had varying degrees of necrosis gene expression，and Fas expression（0.23±0.17），F(xiàn)asL expression（0.21±0.09），necrotic area（23.41±5.37）of the experimental group were lower than those of the control group，F(xiàn)as expression（0.59±0.16），F(xiàn)asL expression（0.51±0.04），necrotic area（41.66±4.19），and the differences were statistically significant（P＜0.05）；after the test，myocardial tissue electrophoresis results showed a different levels of expression in the experimental group and the control group，The experimental group was significantly lower than the control group Fas／FasL level of mRNA.ConclusionTrimetazidine hydrochloride could significantly reduce the level of myocardial ischemia and reperfusion apoptosis，and slow myocardial reperfusion injury by suppressing the expression of Fas，F(xiàn)asL gene，which has the guiding significance for the treatment of myocardial ischemia disease.

trimetazidine hydrochloride；myocardial ischemia；reperfusion；apoptosis；FasL

R541.4

A

1005－1678（2014）09－0027－04

廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目（3502Z20114002）

郭麗蓉，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，E-mail：melodyglr＠163.com。