高華，朱長明，王濤，白利平，康向鵬，閆峰

（廈門大學附屬中山醫(yī)院胃腸外科，福建廈門361004）

PI3K 和MAPK抑制劑對胃腸道間質瘤細胞系GIST-T1細胞增殖和凋亡的影響

高華，朱長明，王濤，白利平，康向鵬，閆峰Δ

（廈門大學附屬中山醫(yī)院胃腸外科，福建廈門361004）

目的研究胃間質瘤中（磷脂酰肌醇-3-激酶）PI3K和（絲裂原活化蛋白激酶）MAPK信號通路對FOXO1的活性調節(jié)及胃間質瘤細胞增殖和凋亡的影響。方法采用PI3K信號通路抑制劑LY294002和MAPK信號通路特異性抑制劑UO126單獨或聯合處理細胞，CCK-8法檢測其對細胞增殖的影響；Western blot檢測FOXO1、p-FOXO1蛋白及信號下游蛋白Bcl2、Bax表達的變化；免疫熒光法檢測FOXO1蛋白在GIST-T1細胞中的細胞定位的變化。結果與DMSO組相比，LY294002和UO126單獨、聯合處理組GIST-T1細胞增殖明顯受到抑制（P＜0.05），且呈時間依賴性。Western blot結果顯示，總FOXO1蛋白表達水平未見顯著變化，而p-FOXO1及Bcl2蛋白表達下降（P＜0.05），Bax蛋白的表達增加（P＜0.05）。免疫熒光顯示FOXO1在GIST-T1細胞中的細胞核移位明顯增多。LY294002和UO126聯合處理GIST-T1細胞較藥物單獨應用時作用效果顯著增強（P＜0.05）。結論LY294002和UO126能夠抑制GIST-T1細胞增殖；PI3K和MAPK信號通路能通過調節(jié)FOXO1蛋白磷酸化水平，使其轉錄活性受到抑制，進而抑制Bcl2的表達，增加Bax的表達，且2種抑制劑作用效果具有協同效應。

FOXO1；PI3K；MAPK；胃腸道間質瘤；Bcl2；Bax

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是消化道最常見的間葉組織腫瘤，是一種具有惡性潛能的胃腸道腫瘤［1］。GISTs發(fā)病率約為1～2例／10萬人口，發(fā)病率有逐年增加的趨勢［2］。FOXO1是FoxO蛋白家族成員，現已發(fā)現FOXO1與細胞凋亡、DNA損傷／修復、細胞自噬、氧化應激、血管生成和糖代謝等密切相關［3-5］。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI-3K）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是調節(jié)FOXO1的關鍵信號通路，FOXO1的靶基因與細胞增殖、細胞凋亡、代謝和遷移等關系密切［6］。研究表明FOXO1因子高表達能夠抑制細胞增殖［7］。FOXO1可以通過磷酸化、乙?；榷喾N調節(jié)方式影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但PI3K和MAPK信號通路在胃間質瘤中對FOXO1轉錄因子活性調節(jié)的機制尚不明確。本實驗旨在研究GIST-T1細胞中PI3K和MAPK信號通路對FOXO1轉錄因子活性與細胞內定位及其下游凋亡相關因子Bcl2、Bax表達的調控機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和細胞培養(yǎng) PI3K抑制劑LY294002和MAPK抑制劑UO126（Sigma Aldrich公司）；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco公司）；FOXO1抗體、p-FOXO1（s256）抗體、Bcl2抗體、Bax抗體（Cell Signaling公司）；兔抗人GAPDH抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（Santa Cruze公司）；TRITC標記的山羊抗兔IgG抗體、CCK-8試劑盒（生工公司）；DAPI（Roche公司）。

GIST-T1細胞系（百恩維公司），以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，取生長良好，呈對數期細胞進行實驗。

1.2 CCK-8檢測GIST-T1細胞的增殖抑制率 取GIST-T1單細胞懸液，以每孔4×103個細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，血清饑餓24 h，處理組分別加入30μmol／L LY294002（LY294002組），10μmol／L UO126（UO126組），30μmol／L LY294002＋10 μmol／L UO126（即：LY＋UO組），對照組加入等量DMSO，每組5個重復孔，分別作用0、12、24、36、48h后，加入10μL CCK-8試劑，37℃孵育1 h。輕微溶解震蕩，450 nm為吸收波長，酶標儀測量各孔吸光度。抑制率＝（對照組OD值×實驗組OD值）／對照組OD值×100%。

1.3 Western blot檢測FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表達 將細胞接種于6孔板，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，血清饑餓24 h后，分別加入30μmol／L LY294002（LY294002組），10μmol／L UO126（UO126組），30μmol／L LY294002＋10μmol／L UO126（即LY＋UO組），對照組加入等體積的DMSO（抑制劑溶解在DMSO中），抑制劑作用24 h后收集細胞。加入RIPA裂解液置于冰上裂解30min，超聲波細胞破碎儀破碎細胞3次，4℃，12000 r／min離心10min后取上清，用BCA法進行蛋白定量，調整樣品濃度使其相同，蛋白經10%或15% SDS-PAGE電泳后，濕轉法轉移至PVDF膜上后以5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（稀釋倍數1∶1000）置于4℃冰箱孵育過夜，經洗滌后，再加入HRP標記的二抗（稀釋倍數1∶2000），室溫孵育2 h，洗滌后加入ECL顯影液顯影，自動成像儀采集圖像后以GAPDH為內參用Quantity One灰度分析軟件進行灰度分析。

1.4 免疫熒光檢測FOXO1的細胞定位變化 將GIST-T1細胞以1×104個／孔的密度接種于6孔板中的玻片上，待細胞貼壁后每孔加1mL培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后，血清饑餓24 h，處理組分別加入LY294002（濃度30μmol／L）、UOl26（濃度10μmol／L）、LY294002（濃度30μmol／L）和UO126（濃度10μmol／L），對照組加入等量DMSO。處理24 h后取出爬片細胞，洗滌后丙酮固定20 min，0.5%Triton-100進行細胞通透20min，然后用1%BSA封閉30 min，加入一抗（稀釋倍數1∶1000）4℃孵育過夜，加入二抗室溫避光孵育2 h，洗滌后DAPI染核15 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計分析軟件進行統計學分析，實驗數據用±s”表示，組間比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種信號通路抑制劑對GIST-T1細胞的增殖抑制作用

CCK-8結果顯示，與DMSO組相比，經LY294002（濃度30 μmol／L）和UO126（濃度10μmol／L）分別處理的GIST-T1細胞，隨著處理時間的增加，細胞增殖受抑制程度增強（P＜0.05）。LY＋UO組較LY294002組或UO126組細胞的增殖抑制作用更加顯著（P＜0.05），藥物作用36 h時細胞大量死亡（見圖1）。

圖1 單獨或聯合應用LY294002、UO126對胃間質瘤細胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of LY294002 and UO126 alone or in combination on GIST-T1 cell proliferation

2.2 FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白表達的變化Western blot結果顯示，與DMSO組相比，LY294002（濃度30 μmol／L）及UO126（濃度10μmol／L）分別或聯合處理GIST-T1細胞24h均可引起細胞中的p-FOXO1、Bcl2蛋白水平下降，Bax蛋白表達水平增加，且LY＋UO組p-FOXO1、Bcl2表達下降更為顯著，Bax蛋白表達增加更為顯著，差異均有統計學意義（P＜0.05）。但LY294002組、UO126組、LY＋UO組與DMSO組相比，總FOXO1蛋白表達差異無統計學意義（見圖2）。

圖2 單獨或聯合應用LY294002、UO126處理GIST-T1細胞后FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax的表達*P＜0.05，與DMSO組相比Fig.2 Expression of FOXO1，p-FOXO1，Bcl2 and Bax in GIST-T1 cell after treated with LY294002 and UO126 alone or in combination *P＜0.05，compared with DMSO group

2.3 FOXO1蛋白在細胞中的定位變化 免疫熒光結果顯示，DMSO組FOXO1在細胞核和細胞漿中分布廣泛，LY294002（濃度30μmol／L）、UO126（濃度10μmol／L）處理GIST-T1細胞24h后，細胞漿FOXO1明顯減少，細胞核FOXO1相應增加，且LY＋UO組FOXO1胞核移位較單獨應用LY294002、UO126組更加明顯（見圖3）。

圖3 單獨或聯合應用LY294002、UO126處理GIST-T1細胞后FOXO1定位Fig.3 Localization of FOXO1 in GIST-T1 cell after treated with LY294002 and UO126 alone or in combination

3 討論

胃間質瘤的發(fā)病機制與細胞增殖失控和細胞凋亡抑制關系密切，FOXO1是參與細胞增殖、細胞凋亡調節(jié)的重要轉錄因子。有研究指出FOXO1能夠參與調節(jié)包括Bcl2、Bax等凋亡相關因子的表達，其活性受到磷酸化、乙?；刃揎椃绞秸{節(jié)［8］。而PI3K和MAPK信號通路作為FOXO1轉錄因子的重要調節(jié)通路，直接參與FOXO1的磷酸化修飾過程，進而影響FOXO1的轉錄活性及其下游靶蛋白的表達［6］。Bcl2家族是最早研究的凋亡相關基因，其中Bcl2具有抗凋亡作用，而Bax具有促凋亡作用，在多種腫瘤中發(fā)現兩者的比例失調［9］。Bcl2過表達抑制細胞凋亡，而Bax過表達促進細胞凋亡［10］。FOXO1因子可以通過抑制Bcl2蛋白表達，上調Bax蛋白的表達促進細胞的凋亡［11-12］。但其確切機制尚不明確，進一步研究FOXO1對其表達的調節(jié)機制具有十分重要的意義。

有研究表明，PI3K和MAPK抑制劑能夠抑制FOXO1磷酸化，使FOXO1向細胞核移位，從而調節(jié)FOXO1的轉錄活性，抑制細胞的增殖［13-15］。本研究采用GIST-T1細胞作為研究對象，單獨或聯合應用PI3K信號通路和MAPK信號通路特異性抑制劑處理細胞之后，CCK-8顯示LY294002和UO126組對GIST-T1的增殖具有明顯的抑制作用，LY＋UO組抑制作用更為顯著，且呈時間依賴性。這一結果表明，PI3K信號通路和MAPK信號通路在GIST-T1細胞增殖中起到十分重要的作用。Western blot實驗顯示，PI3K、MAPK抑制劑單獨或聯合作用24 h后，總FOXO1蛋白水平與DMSO組相比沒有明顯的變化，但磷酸化水平明顯降低，這說明PI3K信號轉導通路和MAPK信號轉導通路可以通過改變FOXO1因子的磷酸化水平，影響其轉錄活性，調控細胞的增殖。本實驗結果還提示，隨著FOXO1磷酸化水平降低，Bcl2蛋白表達降低，Bax蛋白的表達水平表現出升高的趨勢，且聯合用藥組較單獨用藥組變化更加顯著，進一步證實PI3K信號通路和MAPK信號通路特異性抑制劑能夠增強FOXO1因子的轉錄活性，進而影響其下游凋亡相關因子的表達。此外，免疫熒光實驗觀察到，GIST-T1細胞給予抑制劑處理后，FOXO1蛋白從細胞漿向細胞核內移位。同時發(fā)現聯合用藥組（LY＋UO組）較單獨用藥組（LY294002組、UO126組）FOXO1蛋白胞核移位更加顯著，說明兩種抑制劑在調節(jié)FOXO1活性方面具有一定的協同效應。

上述實驗數據表明，在胃間質瘤細胞中，PI3K和MAPK抑制劑可以通過抑制FOXO1蛋白磷酸化水平，使FOXO1蛋白向細胞核移位，進而抑制FOXO1因子的轉錄活性，導致Bcl2表達降低，促進Bax的表達，引起細胞周期阻滯、促進細胞凋亡，以及抑制細胞增殖。上述實驗證明PI3K信號通路和MAPK信號通路在胃間質瘤發(fā)生發(fā)展中的部分作用是通過調節(jié)FOXO1因子的轉錄活性，影響其下游凋亡相關因子Bcl2、Bax等的表達實現的。因此，深入研究FOXO1轉錄因子在胃間質瘤中的作用具有重要意義，為胃間質瘤靶向治療藥物的研發(fā)提供了新的方向。

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（編校：吳茜，王冬梅）

Influence of PI3K and MAPK inhibitors on proliferation and apoptosis of gastrointestinal stromal tumor cell line GISIT-T1

GAO Hua，ZHU Chang-ming，WANG Tao，BAILi-ping，KANG Xiang-peng，YAN FengΔ

（Department of Gastrointestinal Surgery，Zhongshan Hospital to Affiliated Xiamen University，Xiamen 361004，China）

ObjectiveTo research the regulatory mechanism of PI3K and MAPK signaling pathways on FOXO1 transcription factor activity and its inhibit effection on gastrointestinal stromal tumor cell proliferation and apoptosis.MethodsGastrointestinal stromal tumor cell line（GIST-T1）was handled alone or in combination with specific PI3K inhibitor LY294002 and MAPK inhibitor UO126.The proliferation of GIST-T1 CCK-8 was examined by CCK-8，the expression of FOXO1，p-FOXO1 Bcl2 and Bax was detected by western blot.The localization of FOXO1 was detected by Immunofluorescence（IF）.ResultsThe growth of GIST-T1 cellswas siginificantly inhibited alone or in combination with LY294002 and UO126，and dependent on duration of the illumination.Western blot showed that the expression of p-FOXO1 and Bcl2 were obvious reduced，but the expression of Bax remarkably increased alone or in combination with LY294002 and UO126 groups（P＜0.05）.Significant changewith total FOXO1 was not found，and immunofluorescence showed FOXO1 was redistributed to the nucleus.The change of protein express and localization in combined group was more remarkable than single groups.ConclusionPI3K inhibitor LY294002 and MAPK inhibitor UO126 can inhibit GIST－T1 cell proliferation.PI3K and MAPK signaling pathway inhibits the transcription activity by adjusting the FOXO1 phosphorylation levels，FOXO1 inhibits GIST-T1 cell proliferation through down regulate the expression of Bcl2，up regulation of Bax and two kinds of inhibitors have synergistic effect.

FOXO1；PI3K；MAPK；gastrointestinal stromal tumor；Bcl2；Bax

R735.2

A

1005－1678（2014）09－0020－04

中國醫(yī)學基金會資助項目（314.2212）

高華，男，碩士，研究方向：胃腸道腫瘤基礎與臨床，E-mail：gaohuadoctor＠163.com；通信作者，閆峰，男，醫(yī)學博士、博士后，副教授、副主任醫(yī)師、碩士研究生導師，E-mail：yanfeng＠xmzsh.com。