孔祥銓，賈志強，孟凡磊，韓秀斌，衣服新

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧錦州121001）

siRNA干擾人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達對U251細胞凋亡的作用機制研究

孔祥銓，賈志強，孟凡磊，韓秀斌，衣服新Δ

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧錦州121001）

目的應用特異性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子-小干擾核糖核酸（brain derived neurotrophic factor-small interfering RNA，BDNF-siRNA）下調(diào)U251細胞中BDNF表達，觀察對膠質瘤細胞凋亡的影響，并初步探討其相關機制。方法將經(jīng)體外培養(yǎng)的人膠質瘤細胞系U251細胞隨機分為3組，其中A組為對照組，B組為non-silencing-siRNA組，C組為BDNF-siRNA組。通過Western blot法檢測細胞BDNF、AKt、pAKt蛋白的表達，ELISA檢測各組BDNF的分泌水平，流式細胞儀法檢測各組U251細胞凋亡情況。結果Western blot結果顯示：與A組和B組相比，C組BDNF、pAKt蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。ELISA結果表明C組U251細胞培養(yǎng)上清中BDNF含量為（70.20±3.05）pg／mL，與A相比有所降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。流式細胞儀檢測結果可見C組細胞的凋亡率為（19.62±2.50）%，顯著高于A組［（1.63±0.61）%］和B組［（1.78±0.94）%］，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論體外培養(yǎng)U251細胞時，采用特異性BDNF-siRNA能夠顯著降低BDNF、pAKt表達，同時，干擾BDNF表達能促進U251細胞的凋亡，推測與TrkB-Akt通路密切相關。

siRNA；BDNF；U251；凋亡

神經(jīng)膠質瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，由于其術后易復發(fā)，5年生存率較低，是一直以來困擾人類醫(yī)學的一大難題。尋找膠質瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路并進行有效的阻斷有助于延長病人的存活時間。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF），是已知的在神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)細胞生長、分化、遷移和凋亡的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員。同時它是人類惡性膠質瘤細胞系中表達最為豐富的營養(yǎng)因子之一［1］。AKt又稱蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是分子量約57 ku的絲／蘇氨酸蛋白激酶，在細胞存活和凋亡中起到重要作用。AKt有AKt1、AKt2和AKt3 3個亞型，同時它們具有共同的結構特征［2］。研究發(fā)現(xiàn)由于AKt活化成pAKt增加了下游信號的傳遞，能夠抑制腫瘤細胞的凋亡，但是其具體機制尚不清楚［3］，同時，Zeng Y等［4］認為pAKt在惡性膠質瘤中的表達亦明顯上調(diào)。近年來針對于AKt治療腫瘤的靶向研究已成為熱點。近年來有學者認為BDNF通過激活其受體TrkB不僅促進神經(jīng)細胞的再生、分化和功能恢復，同時能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞凋亡，這與TrkB-Akt通路密切相關［5-6］。

本研究旨在應用特異性BDNF-siRNA降低BDNF蛋白的表達，探討B(tài)DNF和AKt的相互關系及其對U251膠質瘤細胞的體外培養(yǎng)中的凋亡作用，同時為后續(xù)的試驗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 人神經(jīng)膠質瘤U251細胞（購自中國科學院細胞庫）；BDNF兔多抗（美國Santa Cruz公司）；AKT抗體和pAKT抗體（美國Cell Signaling公司）；兔抗人β-actin單克隆抗體（Santa Cru公司）；BDNF-siRNA及對照（上海吉凱公司）；胎牛血清（北京北方同正生物技術發(fā)展有限公司）；DMEM培養(yǎng)液（hyclone公司）；Annexin V-FITC Kit（美國BD Biosciences公司）；人BDNF QuantikineTMELISA kit（美國R＆D Systems公司）；ECL試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）。

1.2 實驗儀器 HERA cell 150型細胞孵育箱（Thermo公司）；TDL-5A型筒式離心機（上海安亭科學儀器廠）；SW-CJ-1CU型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；微量移液器（Eppendorf公司）；Western-blot電泳儀、電泳槽、轉膜儀（Bio-Rad公司）；ELISA酶標板（JET BIOFIL）；流式細胞儀（美國FACScan Becton Dickinson公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及轉染：人神經(jīng)膠質瘤細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱，在含10%的胎牛血清的DEME培養(yǎng)液中培養(yǎng)。嚴格按照試劑說明書操作，采用脂質體Lipofectamine2000轉染試劑Invitrogen，將non-silencing-siRNA和BDNF-siRNA分別瞬時轉染U251細胞24 h（80%～90%融合）作為B組和C組，A組不做轉染處理。細胞實驗要至少重復3次。

1.3.2 Western blot法檢測細胞蛋白的表達：細胞轉染24 h后，PBS洗滌2次，加裂解緩沖液100μL作用30min后離心，吸取上清，經(jīng)SDS-PAGE緩沖液處理后恒壓電泳轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入抗β-actin（1∶2000）、BDNF（1∶2000）、AKT（1∶2000）、pAKT（1∶2000）一抗，4℃過夜，PBST洗滌3次，滴加HRP標記的抗兔IgG抗體（1∶5000）溫育2 h；PBST洗膜3次×5min，依照ECL說明方法進行顯色。重復試驗3次。用Quantity One分析軟件分析條帶灰度，進行半定量比較分析，并且均采用自身灰度值校正，以目的蛋白的條帶灰度與管家蛋白β-actin的灰度比值表示蛋白的表達水平。

1.3.3 ELISA法檢測細胞蛋白質含量：細胞轉染24 h后，利用離心獲取上清液，測定BDNF的表達水平，按照人BDNF QuantikineTMELISA試劑盒說明操作，用100μL檢測稀釋液稀釋50μL待測樣品或標準品后，加到孔板中室溫培養(yǎng)2 h，再加入100μL BDNF偶聯(lián)抗體室溫培養(yǎng)1 h。充分漂洗，加入200μL底物溶液顯色。應用多功能酶標儀（校正波長設為570 nm），在450 nm波長處測定吸光度值。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率：細胞轉染24 h后，胰酶消化后 PBS洗滌細胞，重新懸浮于 1×結合緩沖液（1×106／mL）。收集各組細胞懸液100μL（1×105～1×106細胞），加5μL Annexin V-FITC和5μL PI充分混勻染色后，溫室避光10～15min。加入400μL 1×結合緩沖液，通過流式細胞儀檢測凋亡細胞率。重復試驗3次。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)數(shù)據(jù)以±s”表示，組間采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot法檢測相關蛋白表達 未轉染siRNA的A組，U251細胞中檢測到BDNF的表達。與A組相比，轉染nonsilencing siRNA的B組中BDNF的表達未見明顯改變，但轉染特異性BDNF-siRNA的C組中BDNF的表達顯著降低（P＜ 0.05，見圖1）。說明特異性BDNF-siRNA能有效抑制U251細胞BDNF的表達。轉染前后AKt表達未見明顯改變；A、B 2組U251細胞中都檢測到pAKt的表達，2者pAKt的表達未見明顯差異，但轉染特異性BDNF-siRNA的C組可見pAKt的表達顯著降低（見圖2），與A組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明特異性BDNF-siRNA能有效抑制U251細胞pAKt的表達。

圖1 特異性siRNA有效抑制U251細胞中BDNF的表達A.對照組；B.非沉默siRNA組；C.BDNF－siRNA組*P＜0.05，與對照組相比Fig.1 Specific siRNA effectively inhibit BDNF expression in U251 cellA.control group；B.non-silencing-siRNA group；C.BDNF-siRNA group *P＜0.05，compared with control group

圖2 特異性BDNF-siRNA轉染的U251細胞中pAKt的表達下降A.對照組；B.非沉默siRNA組；C.BDNF-siRNA組*P＜0.05，與對照組相比Fig.2 Expression of pAKt declined in specific BDNF-siRNA transfected U251 cellA.control group；B.non-silencing-siRNA group；C.BDNF-siRNA group*P＜0.05，compared with control group

2.2 ELISA檢測BDNF表達水平結果 采用ELISA法來檢測U251細胞上清液中BDNF的表達水平。經(jīng)統(tǒng)計學分析可見：A、B 2組U251細胞中都檢測到BDNF的表達，2者BDNF的表達未見明顯差異，但轉染特異性BDNF-siRNA的C組可見BDNF的表達顯著降低，與A組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。說明特異性BDNF-siRNA能有效降低U251細胞BDNF的表達。

表1 ELISA檢測BDNF表達結果（n＝5）Tab.1 Results of BDNF expression detected by ELISA（n＝5）

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率結果 應用流式細胞法檢測干擾BDNF后U251細胞的凋亡情況（見圖3）。A、B、C 3組細胞的凋亡率分別（1.63±0.61）%、（1.78±0.94）%和（19.62±2.5）%，轉染non-silencing siRNA的B組與A組相比，細胞凋亡率未見明顯改變，但轉染特異性BDNF-siRNA的C組與A組相比，細胞凋亡率顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明特異性BDNF-siRNA能促進U251細胞的凋亡。

圖3 流式細胞儀檢測U251細胞凋亡結果A.對照組；B.非沉默siRNA組；C.BDNF-siRNA組Fig.3 Results of U251 cell apoptosis detected by flow cytometryA.Control group；B.non-silencing-siRNA group；C.BDNF-siRNA group

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤以神經(jīng)膠質瘤最為常見，盡管目前針對于膠質瘤的基礎與臨床研究已經(jīng)有所進展，但由于其致死率極高且手術易復發(fā)難以達到滿意的治療效果。隨著基因治療的興起和發(fā)展，與膠質瘤相關的靶向治療受到學者們的重視。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)育和突觸可塑性和神經(jīng)遞質的釋放等作用密切相關［7-8］。BDNF表達于中樞神經(jīng)腫瘤并能增強腫瘤細胞的存活和抵抗化療［9］。同時，有學者認為BDNF／TrkB的信號系統(tǒng)在腫瘤細胞的增殖和存活具有重要意義［10-11］，BDNF／TrkB信號通路是調(diào)節(jié)惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展的有效方式之一［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，通過ELISA法在U251細胞中檢測到BDNF的表達，轉染特異性BDNF-siRNA后，C組BDNF的表達明顯降低，這與研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)BDNF在轉染后表達降低的結果相一致。通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，應用特異性BDNF-siRNA干擾BDNF后，C組膠質瘤U251細胞凋亡率增加，提示內(nèi)源性BDNF具有促進腫瘤細胞存活的能力。因此，研究認為BDNF有助于神經(jīng)膠質瘤細胞的生長并可能成為膠質瘤基因治療的有效靶點。

AKt參與轉錄過程中下游信號的傳遞被普遍認為是腫瘤細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。pAKt是AKt的活化形式，AKt在未活化前沒有生物學功能，只有在活化為pAKt后才能對腫瘤細胞產(chǎn)生生物學效應［14-15］，這與本研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)AKt在轉染前后未見明顯改變的結果相一致。研究認為AKt是PI3K／AKt信號通路的下游靶蛋白，被激活后變成活性的pAKt，介導腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展并可以通過上調(diào)抗凋亡基因的表達抑制細胞凋亡［16-17］。通過Western blot檢測，本研究發(fā)現(xiàn)，在膠質瘤U251細胞中應用特異性BDNF-siRNA干擾BDNF后pAKt較未干擾前表達明顯降低。提示干擾了BDNF蛋白的表達能夠抑制AKt基因的磷酸化，致使pAKt蛋白的表達量減低。結合流式細胞儀的檢測結果研究推測BDNF能夠通過上調(diào)pAKt的含量抑制腫瘤細胞的凋亡，TrkB-Akt作為下級通路起到重要作用。

綜上所述，本研究認為內(nèi)源性BDNF具有促進U251細胞存活和抗凋亡作用，其機制可能是通過激活下游TrkB-Akt信號通路發(fā)揮重要作用。后續(xù)的研究將進一步的明確其詳細機制，期待BDNF及其相關信號通路的研究能夠為膠質瘤的基因治療和靶向藥物研發(fā)提供線索。

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（編校：王冬梅，吳茜）

Studies on themechanism of U251 cell apoptosis by interfering BDNF expression w ith siRNA

KONG Xiang-quan，JIA Zhi-qiang，MENG Fan-lei，HAN Xiu-bin，YIFu-xinΔ

（Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo discuss the effect of siRNA specificly for BDNF on U251 cell apoptosis and its related mechanism.MethodsHuman gliomas cell line U251 were cultured in vitro and divided into three groups，group A as control group，group B as non-silencing-siRNA group，group C as the BDNF-siRNA group.Expression of BDNF，AKt and pAKt in three groupswas examined by Western blotand BDNF secretion levelwas evaluated by ELISA.Cell apoptosis in each graup were examined by flow cytometry instrumentmethod.ResultsWestern blot results showed that compared with group A and group B，protein expression of BDNF，pAKt in group Cwas decreased.ELISA results showed that BDNF concentration in the supernatantof group C was（70.20±3.05）pg／mL，which lower than group A，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The cell apoptosis rate of group C was（19.62±2.50）%，which was higher than group A（1.63±0.61）%and group B（1.78±0.94）%，the difference were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionWhen cultured in vitro，specific BDNF-siRNA can significantly reduce the expression of BDNF，pAKt，meanwhile，when interference expression of BDNF can promote the apoptosis of U251 cell，itmay closely related to the TrkB-Akt pathway.

siRNA；BDNF；U251；apoptosis

R730.5

A

1005－1678（2014）09－0006－04

遼寧醫(yī)學院校長基金（XZJJ20130240）

孔祥銓，男，研究生在讀，研究方向：腦腫瘤基礎與臨床，E-mail：kxq15948032203＠163.com；衣服新，通信作者，男，博士，教授，E-mail：yfx15940676888＠163.com。