劉錦宙，楊燕，謝而付

（1.江西省宜春市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西宜春336000；2.江西省宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西宜春336000；3.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京210029）

STAT6-ORF表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

劉錦宙1，楊燕2，謝而付3

（1.江西省宜春市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西宜春336000；2.江西省宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西宜春336000；3.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇南京210029）

目的本文旨在構(gòu)建STAT6-ORF表達(dá)載體，包裝成慢病毒顆粒。方法應(yīng)用嵌套PCR法從生長狀態(tài)良好的293FT細(xì)胞的cDNA中擴增STAT6的完整讀碼框片段（2544 bp），根據(jù)需要在引物的5′端分別引入Cla I和Mlu I酶切位點，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD20T載體上，得到pMD20T-STAT6-ORF克??；測序驗證后，用Cla I和Mlu I雙酶切pMD20T-STAT6克隆，回收酶切產(chǎn)物得到的STAT6-ORF片段，通過T4 DNA連接酶連接到pLVTHm表達(dá)載體上，經(jīng)雙酶切和測序驗證正確，獲得pLVTHm-STAT6-ORF表達(dá)載體。結(jié)果構(gòu)建帶有增強綠色熒光蛋白EGFP（enhanced green fluorescence protein）標(biāo)記的STAT6-ORF表達(dá)載體，包裝成慢病毒顆粒，結(jié)果表明成功構(gòu)建及包裝帶STAT6-ORF目的片段的慢病毒表達(dá)載體。結(jié)論pLVTHm-STAT6過表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以進行慢病毒包裝與鑒定。

STAT6-ORF；慢病毒顆粒；增強綠色熒光蛋白

在免疫細(xì)胞中，STAT6在IL-4或IL-13的刺激下，通過JAK激酶（janus kinase，JAK）的作用，胞質(zhì)中非磷酸化（失活狀態(tài)）的STAT6蛋白被磷酸化（激活）后形成二聚體，進入細(xì)胞核內(nèi)，識別核內(nèi)特異的DNA結(jié)合元件并與之結(jié)合，啟動下游特定基因的表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，如IgE的產(chǎn)生，Th2細(xì)胞的分化及淋巴細(xì)胞的發(fā)育等［1-5］。但越來越多的研究表明，該信號與癌癥的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)［6-7］。長期慢性的炎癥可以誘發(fā)癌癥，但2者分子交叉機制目前仍不清楚［8-10］。推測可能與IL-4-STAT6信號所介導(dǎo)功能的轉(zhuǎn)變密切相關(guān)［11］。本研究選擇能夠高效率感染目的細(xì)胞的慢病毒載體pLVTHm為骨架構(gòu)建STAT6-ORF表達(dá)載體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒：人胚腎HEK293FT細(xì)胞株，大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α均由南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所保存。

慢病毒載體pLVTHm由南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所提供，pLVTHm能表達(dá)EGFP，載體pMDTM20-T vector為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 人胚腎HEK293FT細(xì)胞株的總RNA提取與純化：TRIzol法提取RNA，異丙醇純化RNA，按下列步驟操作：

細(xì)胞按1×106個／mL密度接種于6孔板培養(yǎng)，經(jīng)處理后棄去上清，每孔加入1mL TRIzol（TAKARA公司產(chǎn)品），靜置5min充分裂解（TRIzol變粘稠）后吸到1.5mLEP管中，或液氮速凍后－80℃保存?zhèn)溆?。?00μL氯仿劇烈振蕩，室溫靜置5 min，4℃，12000 g離心15min。將上清移到新EP管，加等體積（約500μL）異丙醇混勻，室溫靜置10min，4℃，12000 g離心10min。棄上清，500μL 75%乙醇洗滌；4℃，12000 g離心2 min，重復(fù)1次?？账?次（常溫12000 g離心1min）。超凈臺內(nèi)把柱子蓋打開吹1～2min，將柱子放到新的1.5mL EP管。加入10～40μL DEPC（依材料多少而稀釋），62℃2 min，常溫12000 g離心1min，管內(nèi)即為RNA。取1μL用分光光度計（722S型，eppendorf公司，AG）檢測純度和濃度，1μL進行瓊脂糖電泳（配制新鮮的1%瓊脂糖凝膠，置換干凈TAE緩沖液進行電泳）檢測其完整性，余下部分立即保存于－80℃超低溫冰箱中，或立即用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)PrimerScriptTMRT-PCR試劑盒步驟進行操作：在microtube中配制下列混合液：dNTP mixture（10 mM each），1μL；oligo dT primer（2.5μM），1μL；total RNA，100 pg～1μg；RNase free dH2O，10μL。RNA反應(yīng)液離心，65℃，5min處理，迅速轉(zhuǎn)到冰上冷卻，離心數(shù)秒鐘使模板RNA／引物等的混合液聚集于microtube管底部。在上述microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：上述變性、退火反應(yīng)液10μL；5×PrimeScript Buffer 4μL；PrimeScript RNase（for 2 Step）0.5μL；RNase inhibitor（40 U／μL）5μL；總體積20μL。在PCR儀上42℃（－50℃）15～30min進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，之后70℃5 min進行反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)，立即到冰上冷卻，之后4℃保存。反應(yīng)完畢后，取1μL cDNA用分光光度計（eppendorf公司，AG）檢測純度和濃度，并對其稀釋至150 ng／μL，于－20℃保存?zhèn)溆?。余下部分立即保存于?0℃超低溫冰箱中。

1.2.3 擴增STAT6基因：以反轉(zhuǎn)錄所得的第一有義鏈cDNA為模板，根據(jù)序列保守區(qū)利用Primer5.0（PREMIER Biosoft International公司，USA）軟件設(shè)計引物擴增STAT6基因，內(nèi)參基因為GAPDH，引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.2.4 STAT6基因與pMD20-T載體相連

①目的片段回收純化：按凝膠回收試劑盒說明，進行操作。

②感受態(tài)細(xì)胞的制備：

受體菌的培養(yǎng)：從LB平板上挑取新鮮活化的E.coli DH5α取單菌落，接種于3～5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12 h左右，直至對數(shù)生長后期。將此菌懸液以1∶50～1∶100的比例接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，至OD600為0.5左右。

感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法）：將上述細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰浴10min后，于4℃下3000 g離心10min；棄去上清液，用預(yù)冷的CaCl2溶液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴15 min，然后于4℃下3000 g離心10min；棄去上清液，加入4mL預(yù)冷CaCl2溶液（15%甘油，60mmol／L CaCl2），輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴5min后，即制成感受態(tài)細(xì)胞懸液；無菌下將感受態(tài)細(xì)胞分裝至1mL滅菌EP管（每管100μL），液氮速凍貯存于－80℃可保存半年。

③質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（熱激法）：從－80℃冰箱中取100μL感受態(tài)細(xì)胞懸液，冰上放置使其解凍，解凍后立即置于冰上；每管加入連接產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA溶液（含量不超過250 ng，體積不超過10 μL），輕輕混勻，冰上放置30 min；42℃水浴或金屬浴中熱休克90 s，然后迅速置于冰上冷卻5min；向每管中加入1mL無抗性的LB液體培養(yǎng)基，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)45～60min，使細(xì)菌恢復(fù)至正常生長狀態(tài)，表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）；將上述菌液搖勻或全部離心富集后，無菌操作臺中取100μL涂布于含Amp的篩選平板上，吹干平板20～30min，并做好標(biāo)記，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16～24 h。

④將第①步的目的回收片段與pMD20-T載體相連：在微量離心管中配制pMDTM20-T Vector 1.0μL、DNA 0.1 pmol～0.3 pmol、dH2O up to 5μL DNA溶液，全量為5μL；加入5μL（等量）的Solution I（購自TaKaRa公司）；16℃反應(yīng)30 min［室溫（25℃）也能正常進行連接反應(yīng)，但連接效率稍微降低；5min也能正常進行連接反應(yīng)，但連接效率稍微降低；長片段PCR產(chǎn)物（2 kbp以上）進行連接時，連接反應(yīng)時間請延長至數(shù)小時］；全量（10μL）加入至100μL的JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min；42℃加熱45s后，再在冰中放置1min；加入890μL的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60min；在含有Amp的LB固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計數(shù)白色、藍(lán)色菌落；挑選白色菌落，使用菌落PCR法等確認(rèn)載體中插入片段的長度大小，移至錐形瓶中37℃250 r／min培養(yǎng)12 h后進行下述操作。

1.2.5 質(zhì)粒小量提?。簩?7℃培養(yǎng)12～16 h的平板取出，于無菌操作臺中挑取單個克隆放入15mL氨芐青霉素抗性（100 μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，于37℃250 r／min搖菌過夜。對目的片段經(jīng)PCR鑒定正確的菌液進行質(zhì)粒提取，質(zhì)粒提取按試劑盒操作說明進行。

1.2.6 質(zhì)粒測序鑒定：對酶切鑒定正確的重組T載體進行完全反應(yīng)的測序鑒定，并與GenBank公布的序列進行Blast比對（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／NM_001178081.1）。

1.2.7 STAT6過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體pLVTHm-STAT6-ORF構(gòu)建與鑒定

①慢病毒表達(dá)載體pLVTHm線性化：pLVTHm載體采用內(nèi)切酶Cla I和Mlu I進行雙酶切反應(yīng)，獲得粘性末端線性化目的片段，酶切反應(yīng)體系及條件同上。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳5 h（電壓為60 V）、使用膠回收試劑盒回收線性化片段，產(chǎn)物－20℃保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)連接反應(yīng)。

②STAT6-ORF粘末端片段的獲得：將測序正確的重組T載體質(zhì)粒進行Cla I和Mlu I雙酶切反應(yīng)，酶切體系及反應(yīng)條件同上。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳3 h（電壓為60 V）、使用膠回收試劑盒回收粘性末端目的片段，產(chǎn)物－20℃保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)連接反應(yīng)。

③pLVTHm-STAT6-ORF體外重組質(zhì)粒的獲得：將回收的STAT6-ORF片段與pLVTHm線性化片段按4∶1（摩爾比）的比例進行連接，連接反應(yīng)條件為16℃連接過夜，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體pLVTHm-STAT6-ORF。

④重組質(zhì)粒的鑒定：將連接反應(yīng)產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化后，于37℃培養(yǎng)過夜；次日，挑取單個菌落接種到5mL含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃下進行培養(yǎng)，然后對菌液進行PCR鑒定，反應(yīng)條件同上。經(jīng)PCR鑒定正確的菌液通過質(zhì)粒小量提取后，進行Cla I和Mlu I雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系同上。將雙酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果，根據(jù)片段的大小來確定重組載體質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

2 結(jié)果

2.1 RNA鑒定 成功提取總RNA RNA濃度為339.2μg／mL，純度為2.02（A260／A280）。

電泳鑒定：瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)相應(yīng)的條帶（見圖1），表明總RNA提取成功，可以進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

圖1 總RNA電泳圖Fig.1 Total RNA electrophoresis

2.2 cDNA鑒定 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)cDNA濃度為2620.1μg／mL，純度為1.96（A260／A280）。

2.3 成功擴增STAT6基因

2.3.1 對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在相應(yīng)的位置出現(xiàn)明顯的條帶（見圖2），表明成功克隆STAT6基因。

圖2 PCR擴增STAT6基因的鑒定Fig.2 Determination of STAT6 gene amplified by PCR

2.3.2 測序結(jié)果鑒定：應(yīng)用高保真酶和自行設(shè)計的引物進行PCR擴增，PCR結(jié)果顯示成功擴增了STAT6基因ORF的全長片段2544 bp，電泳鑒定后克隆到T載體上，測序驗證結(jié)果（部分）經(jīng)Blast比對，表明擴增的STAT6-ORF沒有發(fā)生突變。

2.4 STAT6-ORF表達(dá)載體構(gòu)建

2.4.1 雙酶切鑒定：成功克隆STAT6-ORF后，連接到T載體上，經(jīng)過測序鑒定后，用Cla I和Mlu I雙酶切，回收STAT6-ORF片段，再通過T4 DNA連接酶連接到pLVTHm表達(dá)載體上，獲得大小與STAT6-ORF相符的約2500 bp大小的片段。

2.4.2 測序鑒定：酶切鑒定后，pLVTHm-STAT6-ORF表達(dá)載體進行測序鑒定，測序結(jié)果（部分）顯示插入序列無堿基突變，表明過表達(dá)載體pLVTHm-STAT6-ORF構(gòu)建無誤。

3 討論

JAK-STAT信號通路是細(xì)胞內(nèi)除Ras-MAPK之外另一條重要的致癌信號通路，其關(guān)鍵分子STAT家族，迄今為止發(fā)現(xiàn)有7個成員，包括STAT1、2、3、4、5a／b和6［1］。近年來，STAT6的研究普遍受到關(guān)注，而該蛋白本身具有生理和病理的雙重功能［2］。生理方面，STAT6是IL-4介導(dǎo)輔助型T細(xì)胞向Th2型分化所必需的上游轉(zhuǎn)錄因子，IL-4信號激活STAT6表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)［3-4］，如IgE的產(chǎn)生，淋巴細(xì)胞的發(fā)育及Th2細(xì)胞的分化等等。此外在敲除STAT6基因的小鼠模型中，研究發(fā)現(xiàn)STAT6基因被敲除的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量的Th1類細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α，IL-12，干擾素γ等［5-6］，這說明STAT6在機體免疫系統(tǒng)中扮演了重要的角色。病理方面，在腫瘤細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)激活STAT6的表達(dá)，具有抗腫瘤的作用，過表達(dá)STAT6則表現(xiàn)為促進腫瘤細(xì)胞的分裂，抗凋亡，以及促進腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而對STAT6缺失、干擾或表達(dá)受抑制，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖減緩，周期受到抑制，促凋亡和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移受阻［12-14］。由此可見STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但其在不同腫瘤中的作用機制卻不一致，有關(guān)腫瘤細(xì)胞中STAT6基因功能學(xué)相關(guān)研究現(xiàn)在正成為熱點［15］。本研究通過構(gòu)建帶有EGFP標(biāo)記的STAT6過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體，實驗結(jié)果顯示，pLVTHm-STAT6過表達(dá)可以進行慢病毒包裝與鑒定。

［1］Aravalli RN，Steer CJ，Cressman EN.Molecular mechanisms of hepatocellular Carcinoma［J］.Hepatology，2008，48（8）：2047－2053.

［2］池俊萌，吳傳新.原發(fā)性肝癌的治療進展［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（18）：2466－2468.

［3］褚大同.腫瘤分子靶向治療的進展及問題［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2006，11（1）：1.

［4］湯釗猷.中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌的思考［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27（5）：449－450.

［5］Nelms K，Keegan AD，Zamorano J，et al.The IL-4 receptor：signaling mechanisms and biologic functions［J］.Annu Rev Immunol，1999，17（9）：701-738.

［6］Callard RE，Matthews DJ，Hibbert L.IL-4 and IL-13 receptors：are they one and the same［J］.Immunol Today，1996，17（3）：108-110.

［7］Leonard WJ，O'Shea JJ.Jaks and STATs：biological implications［J］. Annu Rev Immunol，1998，16（8）：293-322.

［8］Rahaman SO，Vogelbaum MA，Haque SJ.Aberrant Stat3 signaling by interleukin-4 in malignant glioma cells：involvement of IL-13Ralpha［J］.Cer Res，2005，65（7）：2956-2963.

［9］Smerz-Bertling C，Duschl A.Both.interleukin 4 and interleukin 13 induce tyrosine phosphorylation of the 140-kDa subunit of the interleukin 4 receptor［J］.JBiol Chem，1995，270（2）：966-970.

［10］Takeda K，Tanaka T，Shi W，et al.Essential role of STAT6 in IL-4 signalling［J］.Nature，1996，380（6575）：627-630.

［11］Hebenstreit D，Wirnsberger G，Horejs-Hoeck J，et al.Signaling mechanisms，interaction partners，and target genes of STAT6［J］. Cytokine Growth Factor Rev，2006，17（3）：173-188.

［12］Ansel KM，Djuretic I，Tanasa B，et al.RegμLation of Th2 differentiation and IL-4 locus accessibility［J］.Annu Rev Immunol，2006，24（20）：607-656.

［13］Ostrand-Rosenberg S，Grusby MJ，Clements VK.Cutting edge：STAT6-deficientmice have enhanced tumor immunity to primary and metastatic mammary carcinoma［J］.J Immunol，2000，165（11）：6015-6019.

［14］Ostrand-Rosenberg S，Sinha P，Clements V，et al.Signal transducer and activator of transcription 6（STAT6）and CD1：inhibitors of immunosurveillance against primary tumors andmetastatic disease［J］. Cancer Immunol Immunother，2004，53（2）：86-91.

［15］Ni Z，Lou W，Lee SO，Dhir R，et al.Selective activation ofmembers of the signal transducers and activators of transcription family in prostate carcinoma［J］.JUrol，2002，167（4）：1859-1862.

（編校：王儼儼）

Effect of Nesfatin-1 on secretion mechanism of gastric acid and pepsin in rat gastric mucosa

LIU Jin-zhou1，YANG Yan2，XIE Er-fu3

（1.Department of Internal Medicine，Yichun People's Hospital of Jiangxi Province，Yichun，336000，China；2.Yichun Vocational Technical College，Yichun，336000，China；3.Department of Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing，210029，China）

ObjectiveTo observe the effect of Nesfatin-1 on secretion of gastric acid and pepsin in rats gastric mucosa，and explore its possible mechanism.Methods18 male SD rats after intracerebroventricular catheter were divided into，high dose group，low dose group and contral group，each ratwas injected with Nesfatin-1 0.05 g，0.5 g and 5μL equal volume sterile water by the lateral ventricle injection respectively.Gastric juice were collected by pylorus ligation，after 3h the ratswere executed tomeasure changes of their gastric acid and pepsin，and H＋-K＋-ATPase expression levels in gastric tissue was detected by RT-PCR，protein expression levels of histidine decarboxylase（Histidine decarboxylase，HDC）in gastric mucosa was detected by Western blot，histamine content in gastricmucosa was detected by ELISA.ResultsAfter3h of ratswith Nesfatin-1 injection，compared with control group with equal volume of sterile water for injection，the secretion of gastric acid and pepsin was significantly reduced，there was a significant difference（P＜0.01）.The difference of pepsin secretion level between the two groupswas statistical significance（P＜0.05）.Histamine secretion in rat gastric mucosa declined，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with the control group，after treatment，two groups of rats gastric H＋-K＋-ATP enzymemRNA expression was significantly reduced，the differencewas statistically significant（P＜0.01）.Meanwhile HDC protein expression in ratgastricmucosa in high dose group，low dose group decreased significantly compared with the control group，the presence of differences，with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion Intracerebroventricular injection Nesfatin-1，could inhibit the secretion of gastric acid and pepsin，and itsmechanism may inhibit gastric acid secretion by affecting the central nervous system，H＋-K＋-ATP enzymemRNA expression levels，expression of key enzymes.in histamine synthesis pathway.

lateral ventricle injection；rat；gastric acid；pepsin

R392.12

A

1005－1678（2014）08－0069－04

國家自然科學(xué)基金（81101322）

劉錦宙，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：消化內(nèi)科，E-mail：qch1821460064＠163.com。