黃晶，洪鳴

（1.武漢中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢430014；2.南京醫(yī)科大學醫(yī)學科學部，江蘇南京210029）

三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結合及其抗腫瘤活性研究

黃晶1，洪鳴2

（1.武漢中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北武漢430014；2.南京醫(yī)科大學醫(yī)學科學部，江蘇南京210029）

目的本論文以多核螯合Pt（II）抗腫瘤金屬配合物為中心，重點開展了三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結合及其抗腫瘤活性的研究工作。方法將30μM配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與0.09 mM的5′-GMP溶解在水中，37℃條件下孵化24 h，當反應進行到2 h和24 h時，取出反應液，利用電噴霧質(zhì)譜方法檢測反應產(chǎn)物；配制不同濃度比rb（drug-to-nucleotide ratio）的配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（I）和配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（II）與pUC19質(zhì)粒DNA（200 ng）的反應液，37℃下避光孵化12 h，然后在1×TAE buffer（40mM Tris acetate，1mM EDTA）中，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析其在電泳中的遷移情況；配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和II的體外細胞毒活性用白血病細胞株（HL-60）、肺癌細胞株（A-549）和肝癌細胞株（BEL-7402）進行測試。結果電噴霧質(zhì)譜方法檢測反應產(chǎn)物時配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）極易與5′-GMP快速反應，形成單加合物、雙加合物以及三加合物，表明I與5′-GMP較強的結合能力；凝膠電泳實驗中測定的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、II的rb值分別為0.099和0.66，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）使DNA完全解旋所需濃度大大低于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）；體外細胞毒活性測試，從測試結果來看，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）在濃度10－4M保持了較高的抗腫瘤活性，但是在10－5～10－8M范圍內(nèi)，I、II和順鉑對此細胞株幾乎全無毒性，抑制率全部低于40%。結論三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結合對提高藥物在生物內(nèi)的穩(wěn)定性和降低不良反應有利。

抗癌藥物；DNA；鉑

隨著鉑類抗癌藥物臨床使用的推廣，出現(xiàn)了許多難以克服的缺點，如腎毒性、神經(jīng)毒性、肝毒性、耳毒性和骨髓毒性等，并且還存在抗藥性問題［1-3］，這些都嚴重影響患者的治療效果和生活質(zhì)量，成為目前亟待解決的問題。Pt3-L與谷胱甘肽（GSH）的反應研究表明，配合物與GSH形成單取代和雙取代產(chǎn)物，反應過程中整個骨架保持完整，這對提高藥物在生物內(nèi)的穩(wěn)定性和降低不良反應有利［4-7］。GSH與配合物作用的質(zhì)譜動力學顯示，Pt-S之間較強的結合能力導致柔性大的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）快速與GSH結合，并導致配合物發(fā)生分解；由于配體L2的空間位阻限制反應速度，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）與GSH形成加合物較慢，并且在形成加合物的過程中，鉑配合物的結構骨架沒有發(fā)生變化，這有利于提高其在生物體內(nèi)的利用度和減少不良反應［8-10］。這些結果對進一步了解多核鉑類抗癌藥物的結構-活性關系非常重要，并且可為今后合理設計具有高生物活性的多核螯合鉑類配合物提供指導作用。為此，本論文以多核螯合Pt（II）抗腫瘤金屬配合物為中心，重點開展了三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物的DNA結合及其抗腫瘤活性的研究工作。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 甲醇、氯仿、無水乙醚、丙酮、DMSO等常用溶劑均為國產(chǎn)分析純，使用前未經(jīng)純化。對甲基苯腈購自TCI；K2［PtCl4］、2-氯甲基吡啶鹽酸鹽、三（2-氨基乙基）胺、2-氯甲基吡啶、2-氨甲基吡啶、2，4，6-三（4-溴甲基苯基）-1，3，5-三嗪和二異丙基乙基胺均購自阿拉?。籒BS、偶氮二異丁腈（AIBN）和三氟甲磺酸購自國藥。pUC19質(zhì)粒DNA購自大連寶生物有限公司，小牛胸腺DNA（CT-DNA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓（EB）購自sigma。試驗中使用的水milli-Q為超純水。質(zhì)譜使用了LCQ電噴霧質(zhì)譜儀（ESMS，Thermo Scientific），用于擬合質(zhì)譜峰同位素分布方式的軟件為Isopro 3.0。

1.2 方法

1.2.1 配合物與5′-GMP的反應：將30μM配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與0.09mM的5′-GMP溶解在水中，37℃條件下孵化24 h，當反應進行到2 h和24 h時，取出反應液，利用電噴霧質(zhì)譜方法檢測反應產(chǎn)物（見圖1）。

圖1 配合物［Pt3 L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP的反應歷程Fig.1 Reaction mechanism of complexes Iand 5′-GMP

1.2.2 配合物與質(zhì)粒DNA的解旋作用：配制不同濃度比rb（drug-to-nucleotide ratio）的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和II與pUC19質(zhì)粒DNA（200 ng）的反應液，37℃下避光孵化12 h，然后在1×TAE buffer（40mM Tris acetate，1mM EDTA）中，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析其在電泳中的遷移情況。100 V電壓下進行2 h后用0.5μg／mLEB染色，最后用UVP凝膠成像系統(tǒng)完成電泳圖的成像。

1.2.3 配合物的體外細胞毒活性檢測［11］：配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）的體外細胞毒活性用白血病細胞株（HL-60）、肺癌細胞株（A-549）和肝癌細胞株（BEL-7402）進行測試。腫瘤細胞在添加了10%（v／v）熱失活的胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100 U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為310 K下高濕度的95%空氣和5%CO2。配合物對A-549和BEL-7402細胞株的生長抑制活性用磺酰羅丹明B蛋白染色法（sulforhodamine B，SRB）測試。向96孔培養(yǎng)板的每個孔接種100μL粘附腫瘤細胞的培養(yǎng)基，在加入藥物前使其粘附24 h。配合物對HL-60細胞株的生長抑制活性用MTT［3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）－2，5-二苯基溴化四唑］測定。具體步驟：向96孔培養(yǎng)板的每個空井中接種100μL從指數(shù)生長期采集的細胞（含在培養(yǎng)基中），然后按濃度梯度加入待研究的化合物，使最終形成的濃度分別為1×10－4、1×10－5、1× 10－6、1×10－7、1×10－8M。培養(yǎng)板在310 K、含5%CO2的潮濕環(huán)境中孵化48 h，每個孔加入濃度為5mg／mL的MTT溶液40μL后再孵化4 h，然后加入100μL“3組份溶液”（10%SDS-5%異丁醇和12mM HCl）。培養(yǎng)板在37℃下溫育過夜，在分光光度計上測定540 nm波長下溶液的吸光度。

2 結果

2.1 5′-GMP結合性能的電噴霧質(zhì)譜研究 鉑類抗癌藥物在人體內(nèi)的主要進攻靶點是細胞內(nèi)的DNA，鉑類藥物與DNA結合后抑制DNA的復制而導致腫瘤細胞凋亡，達到治療效果［12］。當配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP在37℃下混合反應2 h的時候，出現(xiàn)的2個正離子峰854.83和999.92，分別歸屬為［Pt3LL1Cl2＋GMP］2＋（Pt3C52H60N15O8CCl2P）和［Pt3L1＋2GMP］2＋（Pt3C62H72N20O16P2）。配合物與GMP形成單加合物與雙加合物，以單加合物為主。558.33和667.00分別是單加合物與雙加合物的三電荷峰，可歸屬［Pt3L1Cl＋GMP］3＋（Pt3C52H60N15O8ClP）和［Pt3L1＋2GMPP＋H］3＋（Pt3C62H73N20O16P2）反應進行24 h后，配合物與2個GPM形成的雙加合物的峰增強，單加合物的峰明顯下降，同時出現(xiàn)的新峰517.33是雙加合物的四電荷峰，1181.75為配合物與GMP的三加合物的雙電荷峰，可分別歸屬為［Pt＋3L1＋2GMP＋Na＋2H＋C2H3OH］4＋（Pt3C64H73N20O17P2Na）和［Pt3L1＋3GMP＋2H］2＋（Pt3C72H86N25O24P3）。這說明了反應進行24 h后，配合物與1個GMP形成的加合物少量存在，有一定量的配合物與GMP的三加合物出現(xiàn)，配合物與2個GMP形成的加合物成為主要產(chǎn)物存在于溶液中（見圖2）。

圖2 配合物［Pt3 L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP 37℃下反應2、24 h的電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）Fig.2 Electrospraymass spectrometry（ESI-MS）results of complexes I reactive with 5′-GMP for 2 h，24 h under 37℃

實驗結果表明，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）極易與5′-GMP快速反應，形成單加合物、雙加合物以及三加合物，表明了配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP較強的結合能力。

2.2 凝膠電泳研究配合物與DNA的結合 凝膠電泳方法是研究配合物對DNA解旋能力強弱最有效與直接的方法［13］。把這一配合物與核苷酸濃度比值定義為rb對應于完全解除DNA的超螺旋形式所需的鉑配合物的量。如下圖3所示，實驗中測定的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、II的rb值分別為0.099和0.66，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）使DNA完全解旋旋所需濃度遠低于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）。在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)高濃度的配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）會使部分DNA沉降，這可能是由于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）的剛性結構以及＋3價電荷的陽離子與負電荷的的DNA骨架結合所導致。配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）引起部分DNA沉降導致了配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）的的解旋能力小于I。

配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）（A）、配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）（B）與pUC19質(zhì)粒DNA在37℃溫育12 h的凝膠電泳圖見圖3，其中Lane 1為DNA空白；Lane 2～10（a）的rb值分別為0.033，0.066，0.099，0.132，0.165，0.198，0.231，0.264，0.297；Lane 2～10（b）的rb值分別0.33，0.4125，0.495，0.5775，0.66，0.7425，00.825，0.90775，0.99。

圖3 2種配合物凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis analysis of two compounds

2.3 配合物與GSH結合的電噴霧質(zhì)譜表征 本研究利用電噴霧質(zhì)譜跟蹤谷胱甘肽（GSH）與配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）反應產(chǎn)物及反應速度，從而判斷配合物與GSH的作用活性［14］。

配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與GSH反應進行到2 h時，配合物本身的質(zhì)譜峰全部消失，說明I與GSH反應較快。3個新峰372.58，577.17和1189.00分別歸屬為［Pt2＋2BPA＋GSH＋Na-2H］3＋（Pt2C34H43N9O6SNa），［Pt2＋2BPA＋GSH＋Cl＋Na-2H］2＋（Pt2C34H43N9O6SClNa）和［Pt2＋2BPA＋GSH＋2Cl＋Na-2H］＋（Pt2C34H43N9O6SCl2Na）。配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與GSH結合發(fā)生了分解，3個BPA鉑（II）中心全部與橋連基團分離，而GSH上的S原子分別與2個獨立的Pt（BPA）配位（見圖4）。這種由于與GSH結合而引起配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）的分解與Farrell小組報道的經(jīng)典多核鉑配合物BBR3464的分解類似，與鉑原子配位的N和其相連的柔性鏈上的C原子間的共價鍵斷裂，導致配合物分解。反應進行到24 h，主要的質(zhì)譜峰沒有發(fā)生改變；溶液中的主要物質(zhì)還是GSH結合2個Pt（BPA）。

圖4 配合物［Pt3 L1Cl3］Cl3（I）與5′-GMP 37℃下反應2、24 h的電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）Fig.4 Reaction of［Pt3 L1Cl3］Cl3（I）and 5′-GMP for 2 h，24 h，37℃detected by ESI-MS

配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）和GSH反應的結果與配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）不同。當配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）與GSH孵化2 h，檢測溶液的正離子峰主要是配合物的離子峰，而出現(xiàn)的1個較弱的新的正離子峰952.33，是配合物與GSH形成的1個單加合物，可歸屬為［Pt3L2Cl2＋GSH-2H］2＋（Pt3C70H69N15O6Cl2S）。反應到24 h，雖然Ⅱ與GSH的單加合物峰繼續(xù)增加，但是配合物本身峰的強度依然很大，說明反應消耗的反應物較少（見圖5）。

圖5 配合物［Pt3 L2Cl3］Cl3（II）與GSH 37℃下反應2、24 h的電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）Fig.5 Reaction of［Pt3 L2Cl3］Cl3（II）and 5′-GMP for 2 h，24 h，37℃detected by ESI-MS

實驗結果表明，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）與GSH反應速度較快，并且由于與GSH結合導致配合物的分解，這與連接3個BPA鉑中心的基團柔性太大有關系，當S與鉑配位后而致使化學鍵斷裂，配合物分解。雖然Pt-S之間有較強的結合能力，由于配體L2的空間位阻作用，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）與GSH反應速度較慢。因為配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）骨架結構的剛性強于配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I），形成了加合物，配合物的骨架依然保持完整，沒有因為S與鉑配位而致使配合物分解。

2.4 體外細胞毒活性測試 配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）的體外細胞毒活性實驗選用白血病細胞株（HL-60），肺癌細胞株（A-549）和肝癌細胞株（BEL-740）進行了測定［15］。對于肺癌細胞株，配合物在所檢測的范圍內(nèi)對細胞的抑制率都高于順鉑（見圖6）。

圖6 12細胞毒活性圖Fig.6 Cytotoxic activity diagrams

從測試結果來看，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）在濃度10－4M保持了較高的抗腫瘤活性，但是在10－5～10－8M范圍內(nèi)，配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）和順鉑對此細胞株幾乎全無毒性，抑制率全部低于 40%。順鉑、配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）、配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）對肝癌細胞株的作用結果顯示與肺癌細胞株類似的結果。配合物作用于白血病細胞株的實驗中，在10－4M濃度，順鉑對細胞的抑制率高于配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II），濃度降低后，配合物與順鉑對細胞的抑制率降幅較大，表現(xiàn)出較低的毒活性?？偟膩碚f，對于A-549和BEL-7402細胞株，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）表現(xiàn)出比I和順鉑更好的細胞毒活性。

3 討論

本文選用柔性的三乙胺和剛性的2，4，6-三（4-甲基苯）-1，3，5-三嗪橋連3個Pt-BPA配位基團合成了2個三氮螯合單功能三核鉑（II）配合物。凝膠電泳實驗表明配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）的解旋能力強于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II），這是由于配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）容易引起DNA沉降所致。此外，這些配合物的DNA結合能力又與其抗腫瘤活性有著內(nèi)在聯(lián)系。體外細胞毒活性研究表明，對于A-549和BEL-7402細胞株，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）表現(xiàn)出比配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）和順鉑更好的細胞毒活性，但是總體抗腫瘤活性較低。GSH與配合物作用的質(zhì)譜動力學顯示，Pt-S之間較強的結合能力導致柔性大的配合物［Pt3L1Cl3］Cl3（I）快速與GSH結合，并導致配合物發(fā)生分解；由于配體L2的空間位阻限制反應速度，配合物［Pt3L2Cl3］Cl3（II）與GSH形成加合物較慢，并且在形成加合物的過程中，鉑配合物的結構骨架沒有發(fā)生變化，這有利于提高其在生物體內(nèi)的利用度和減少不良反應。這些結果對進一步了解多核鉑類抗癌藥物的結構－活性關系非常重要，并且可為今后合理設計具有高生物活性的多核螯合鉑類配合物提供指導作用。

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（編校：吳茜，王儼儼）

Study on three single-function of three nuclear nitrogen chelating p latinum（II）com p lex DNA conjugates and its anti-tumor activity

HUANG Jing1，HONGMing2

（1.Department of Respiratory Medicine，Wuhan Central Hospital，Wuhan 430014，China；2.Department of Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the conjugate ofmulticore chelating Pt（II）anti-tumormetal complexes and focus on the following research work.Methods30μM complexes Iand 0.09 mM 5′-GMPwere dissolved in water，and incubated for 24 h under the condition of 37℃.When the reaction was carried out for2 h and 24 h，the reaction solution was removed and reaction productswere detected by electrospray ionizationmass spectrometry；the reaction liquids of Iand IIand pUC19 plasmid DNA（200 ng）were prepared at different concentrations（drug-to-nucleotide ratio）and were incubated for 12 h in dark，37℃，and then themigration in capillary electrophoresiswas analyzed by 1%agarose gelelectrophoresis in 1×TAE buffer（40mM Tris acetate，1mM EDTA）；cytotoxicity of complexes Iand II in vitrowas tested by human leukemia cell line（HL-60），lung cancer cell line（A-549）and hepatocellular carcinoma cell line（BEL-7402）.ResultsElectrospray ionization mass spectrometry method for the detection of reaction product showed that complexes of Iand 5′-GMP responsed quickly and adduct of single，double adduct and three adducts formated，which showed I and 5′-GMP had strong binding ability；Rb values of I，IIwere 0.099 and 0.66 determinated by gel electrophoresis，and complexes I concentration of DNA unwinding was considerably less than complex II；the in vitro cytotoxicity test results showed，the complex II maintained higher antitumor activity in the concentration of10－4M，but I，IIand cisplatin were almost all non-toxic for this cell line in the 10－5～10－8M range，and inhibition rateswere lower than 40%.Conclusion Three single function of three nuclear nitrogen chelating platinum（II）complex DNA conjugates could improve stability of drugs in vivo and reduce the adverse reactions.

anti-tumor drugs；DNA；platinum

R96

A

1005－1678（2014）08－0065－05

國家自然科學基金（81100352）

黃晶，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：肺部感染，肺部腫瘤，E-mail：qch1821460038＠163.com。