李鐵軍，郭小文

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院麻醉科，遼寧建平110032；2.浙江省中醫(yī)院麻醉科，浙江杭州310006）

PICK 1抑制劑FSC231的鎮(zhèn)痛作用研究

李鐵軍1，郭小文2

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院麻醉科，遼寧建平110032；2.浙江省中醫(yī)院麻醉科，浙江杭州310006）

目的研究蛋白激酶Cα相互作用蛋白1（protein interacting with Cαkinase 1，PICK1）抑制劑FSC231的鎮(zhèn)痛作用，為開發(fā)可用于臨床疼痛治療的PICK1抑制劑提供依據(jù)。方法選用40只昆明種小鼠分別于右后掌皮下注射1.4%醋酸溶液、腹腔注射0.6%醋酸溶液制備醋酸致痛模型、左側(cè)足趾注射20μL完全弗氏佐劑（CFA）溶液制備炎癥性疼痛模型，左后足趾注射辣椒素溶液制備神經(jīng)源性疼痛模型。將以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：對(duì)照組和FSC231 3個(gè)劑量給藥組，每組10只。FSC231 3個(gè)劑量給藥組分別于造模成功后腹腔注射FSC231 7.83、39.20、78.40μg／kg，給藥1次。對(duì)照組動(dòng)物注射等體積的生理鹽水。給藥1 h后，分別測(cè)定小鼠后掌抬腿次數(shù)、抑制率、小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)、潛伏期、小鼠熱痛閾值、腳爪腫脹體積，熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）和機(jī)械痛閾值。結(jié)果與對(duì)照組比較，F(xiàn)SC231可劑量依賴性（7.83～78.40）μg／kg減少小鼠5min內(nèi)抬腿次數(shù)和6～10min內(nèi)抬腿次數(shù)，6～10min內(nèi)抑制率分別為18.74%、32.59%和45.52%；與對(duì)照組比，不同劑量FSC231均可一定程度延長(zhǎng)小鼠的致痛潛伏期，但僅高劑量組小鼠的鎮(zhèn)痛潛伏期有顯著增加（P＜0.05）；FSC231可劑量依賴性（7.83～78.40）μg／kg減少小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)，其中以高劑量組的作用最為顯著（P＜0.01）。左側(cè)足趾注射完全弗氏佐劑（CFA）溶液后，小鼠出現(xiàn)舔患足，且患足出現(xiàn)紅、腫等現(xiàn)象，表明成功制備了小鼠慢性炎性疼痛模型。給予不同劑量的FSC231后，給藥組基礎(chǔ)痛閾值較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），但后肢足腫脹體積顯著增加（P＜0.05）。小鼠左后足趾注射辣椒素后其熱縮足反射潛伏期（TWL）和機(jī)械痛閾值明顯降低，表明成功制備神經(jīng)病理性疼痛模型。FSC231可劑量依賴性（7.83～78.40μg／kg）升高TWL及機(jī)械痛閾值（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論P(yáng)ICK1抑制劑FSC231對(duì)化學(xué)刺激性疼痛、炎癥性疼痛以及神經(jīng)源性疼痛均具有明顯鎮(zhèn)痛作用，表明PICK1可作為鎮(zhèn)痛作用的新靶點(diǎn)，而PICK1抑制劑FSC231可作為鎮(zhèn)痛作用的候選藥物。

PICK1；鎮(zhèn)痛；完全弗氏佐劑；FSC231

蛋白激酶Cα相互作用蛋白1（protein interacting with Cα kinase 1，PICK1）廣泛分布在人和動(dòng)物的組織細(xì)胞內(nèi)，其PDZ結(jié)構(gòu)域與BAR結(jié)構(gòu)域能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用，形成一個(gè)蛋白募集結(jié)構(gòu)，募集多種蛋白趨向特定部位，從而參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，PICK1參與如疼痛、精神分裂癥、帕金森綜合癥、癌癥等疾病的發(fā)生，在上述疾病中扮演重要角色［1］。目前PICK1在這些疾病發(fā)生過程中的確切作用機(jī)制還不清楚，但是自1995年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已報(bào)道其能與40多種蛋白發(fā)生作用，并執(zhí)行諸多功能。利用某些小分子化合物或者多肽可以特異性地調(diào)節(jié)PICK1與其特異性配體蛋白的相互作用，從而為研究治療與這些配體相關(guān)蛋白的疾病提供了研究思路［2-5］。本課題采用醋酸致痛小鼠模型、完全弗氏佐劑致炎癥性疼痛模型、辣椒素溶液致神經(jīng)源性疼痛模型，觀察醋酸經(jīng)足底注射、經(jīng)腹腔注射后小鼠疼痛行為學(xué)的變化；完全弗氏佐劑經(jīng)足底注射后熱痛閾以及炎癥反應(yīng)的變化；辣椒素經(jīng)足底注射后TWL和機(jī)械痛閾值的變化。在確認(rèn)模型制備成功后，比較不同劑量的PICK1特異性抑制劑FSC231經(jīng)小鼠腹腔注射給藥后的疼痛行為學(xué)變化，觀察不同劑量的FSC231對(duì)上述致痛模型動(dòng)物鎮(zhèn)痛作用效果，為開發(fā)可用于臨床疼痛治療的PICK1抑制劑提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)健康昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量25～30 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（鄂）2008－0005。動(dòng)物室飼養(yǎng)溫度（23±2）℃、濕度50%～60%、人工光照明暗各12 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品與試劑：FSC231（德國(guó)默克，分子量313.14，CAT529531），先用DMSO將FSC231配成10mM的儲(chǔ)存液，再根據(jù)需要加入適量的生理鹽水將FSC231配制成1.57、7.85、15.70μg／mL的溶液，避光冷藏待用；冰醋酸（密度1.05 g／mL，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)99.7%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），實(shí)驗(yàn)前分別用蒸餾水將冰醋酸配制成1.4%、0.6%的醋酸溶液，避光保存于棕色試劑瓶中待用；

完全弗氏佐劑（CFA，Sigma試劑公司）；辣椒素（TOCRIS公司，用無(wú)水乙醇、Tween 80、生理鹽水按1∶1∶8比例配成溶劑，以此溶劑溶解辣椒素粉配成33mM的辣椒素溶液）；注射用生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，每瓶500 mL）；三蒸水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 儀器：1096AF超聲波清洗儀（寧波榮順科技儀器廠）；微量加樣器（Eppendorf，德國(guó)）；電子分析天平（AEL-200型，湘儀天平儀器廠）；秒表（504型，北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司）；PL-200熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）；PV-200足趾容積測(cè)定儀（成都泰盟科技有限公司）；RB-200智能熱板儀（上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司）；VONFREY測(cè)痛儀（法國(guó)Bioseb公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模：40只健康雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為以下4組：FSC231低、中、高劑量組和對(duì)照組。3個(gè)給藥組分別腹腔注射FSC231 7.83、39.20、78.40μg／kg，1 h后在小鼠右后掌皮下注射1.4%醋酸溶液10μL，立即放入實(shí)驗(yàn)觀察盒中觀察注射后5min內(nèi)及6～10min內(nèi)小鼠注射側(cè)右后掌的抬腿次數(shù)。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水1 h后，在小鼠右后掌皮下注射1.4%醋酸溶液10μL，也立即放入實(shí)驗(yàn)觀察盒中觀察注射后5min內(nèi)及6～10min內(nèi)小鼠注射側(cè)右后掌的抬腿次數(shù)。在實(shí)驗(yàn)前3 d，每天將小鼠靜置于1000mL燒杯中0.5 h，使其在實(shí)驗(yàn)燒杯里適應(yīng)。室溫控制在23℃，濕度50%～60%，保證室內(nèi)充足光照，實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制在8：00～18：00。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)：FSC231對(duì)醋酸致痛小鼠自發(fā)縮足反射的影響：觀察注射后5min內(nèi)及6～10 min內(nèi)小鼠注射側(cè)右后掌抬腿次數(shù)，計(jì)算小鼠舔咬抑制率，其計(jì)算公式如下［6］：抑制率＝（對(duì)照組平均縮足次數(shù)－FSC231組平均縮足次數(shù)）／對(duì)照組平均縮足次數(shù)×100%。

FSC231對(duì)醋酸致痛小鼠扭體反應(yīng)的影響：觀察注射醋酸后小鼠第1次開始出現(xiàn)扭體的時(shí)間（潛伏期），當(dāng)小鼠出現(xiàn)典型的腹部?jī)?nèi)凹，同時(shí)伴有軀干扭曲，臀部抬高以及后肢伸長(zhǎng)等特征性反應(yīng)時(shí)，認(rèn)為是一次扭體的發(fā)生［7］，再一直持續(xù)觀察小鼠扭體的發(fā)生，記錄從第1次出現(xiàn)扭體反應(yīng)后的15min內(nèi)小鼠出現(xiàn)扭體的總次數(shù)［8］。

FSC231對(duì)慢性炎性疼痛的影響：觀察小鼠的精神狀態(tài)及其左后足的變化（如紅、腫情況，足底注射處是否有滲液或感染等），采用PL-200熱刺痛儀測(cè)量小鼠的熱痛閾值；用PV-200足趾容積測(cè)定儀測(cè)量其左足的體積，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)［9］。

FSC231對(duì)辣椒素致小鼠神經(jīng)病理性疼痛熱痛閾和機(jī)械痛閾的影響：將實(shí)驗(yàn)小鼠置于玻璃圓柱罩中，圓柱罩下為鑿孔工作臺(tái)。待小鼠適應(yīng)環(huán)境后，以VonFrey纖維刺激小鼠注射辣椒素側(cè)足底，從細(xì)至粗，每種型號(hào)刺激針刺激10次，每次間隔5 s。小鼠會(huì)出現(xiàn)抬足和縮足等反應(yīng)。當(dāng)VonFrey纖毛針曲成90°時(shí)小鼠仍不抬足，判斷小鼠對(duì)此纖維無(wú)反應(yīng)。以出現(xiàn)5次以上縮足反應(yīng)為陽(yáng)性，記錄能夠引發(fā)縮足反應(yīng)的最小力度為機(jī)械性痛閾（g）。于注射辣椒素之前以及注射辣椒素之后的0.5 h測(cè)定每組小鼠后足的機(jī)械性痛閾［10］。

2 結(jié)果

2.1 FSC231對(duì)醋酸致痛小鼠自發(fā)縮足反射影響 與對(duì)照組比較，F(xiàn)SC231可劑量依賴性（7.83～78.40）μg／kg減少小鼠5 min內(nèi)抬腿次數(shù)和6～10min內(nèi)抬腿次數(shù)，6～10min內(nèi)抑制率分別為18.74%、32.59%和45.52%（見表1）。

表1 FSC231對(duì)醋酸致痛小鼠自發(fā)縮足反射影響Tab.1 Effect of FSC231 on acetic acid induced pain in mice spontaneous flinching reflex

2.2 FSC231對(duì)醋酸致痛小鼠扭體反應(yīng)的影響 不同劑量的FSC231均可一定程度延長(zhǎng)小鼠的致痛潛伏期，但與對(duì)照組相比，僅高劑量組小鼠的鎮(zhèn)痛潛伏期有顯著增加（P＜0.05）。FSC231可劑量（7.83～78.4）μg／kg依賴性減少小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)，其中以高劑量組的作用最強(qiáng)（見表2）。

表2 FSC231對(duì)醋酸致痛小鼠扭體反應(yīng)的影響Tab.2 Effect of FSC231 on writhing reaction ofmice with pain induced by acetic acid

2.3 FSC231對(duì)慢性炎性疼痛的影響 小鼠給予CFA后，盡管其毛發(fā)、飲食和自主活動(dòng)均正常，但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)常舔患足，且多數(shù)小鼠注射肢均出現(xiàn)紅、腫等現(xiàn)象，且模型對(duì)照組小鼠在給予CFA后基礎(chǔ)痛閾值顯著降低，后肢腫脹體積顯著增大，表明在給予CFA后成功制備了小鼠慢性炎性疼痛模型。與模型對(duì)照組相比，F(xiàn)SC231可劑量（7.83～78.4）μg／kg依賴性升高小鼠的基礎(chǔ)痛閾值，但不同劑量的FSC231均不能顯著改善小鼠的后肢腫脹體積，反而會(huì)顯著增加小鼠的后肢體積（見表3）。

表3 FSC231對(duì)CFA誘導(dǎo)的小鼠基礎(chǔ)痛閾和后肢體積改變的影響Tab.3 Effect of FSC231 on pain threshold and hind limb volume ofmicemodel induced by CFA

2.4 FSC231對(duì)辣椒素致小鼠神經(jīng)病理性疼痛熱痛閾和機(jī)械痛閾的影響結(jié)果 小鼠給予辣椒素后，盡管其毛發(fā)、飲食和自主活動(dòng)均正常，但熱縮足反射潛伏期（TWL）和機(jī)械痛閾值顯著降低，表明成功制備神經(jīng)病理性疼痛模型。給予FSC231后，辣椒素誘導(dǎo)的TWL和機(jī)械痛閾值下降均有不同程度的升高，其中以高劑量組升高最為顯著（見表4）。

表4 FSC231對(duì)辣椒素致小鼠神經(jīng)病理性疼痛熱痛閾和機(jī)械痛閾的影響Tab.4 Effect of FSC231 on neuropathic pain mice capsaicin induced heat and mechanical pain sensitivity

3 討論

醋酸致痛小鼠自發(fā)縮足反射實(shí)驗(yàn)是一個(gè)簡(jiǎn)便可靠的評(píng)價(jià)藥物鎮(zhèn)痛作用的方法，適用于外周鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)的研究［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論在0～5min還是6～10min內(nèi)，F(xiàn)SC231不同劑量組均能夠顯著減少小鼠自發(fā)縮足反射次數(shù)，與對(duì)照組差異顯著，表明PICK1的特異性抑制劑FSC231具有顯著的外周鎮(zhèn)痛作用。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SC231的外周鎮(zhèn)痛作用呈現(xiàn)較明顯的劑量依賴性特征，隨著給藥劑量的增加，縮足反射的抑制率顯著增加，表明其鎮(zhèn)痛作用越明顯。

小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)是通過腹腔注射一定濃度的醋酸刺激，引起小鼠腹膜劇烈化學(xué)性刺激而產(chǎn)生疼痛，小鼠行為表現(xiàn)為扭體反應(yīng)。這種傷害性反應(yīng)可能由于注射醋酸后，小鼠腹腔pH值過低而刺激傷害性傳入神經(jīng)纖維和炎癥遞質(zhì)合成共同作用所導(dǎo)致［12］。向小白鼠腹腔內(nèi)注入化學(xué)刺激物可引起深部的、大面積而較持久的疼痛刺激，致使小白鼠產(chǎn)生“扭體”反應(yīng)，如腹部?jī)?nèi)凹（呈蜂腰狀）、軀干與后腿伸張、臀部高起等。常用鎮(zhèn)痛藥均對(duì)此有抑制作用，可明顯減少發(fā)生“扭體”反應(yīng)的小鼠數(shù)［13］。通過觀察記錄小鼠的扭體反應(yīng)，可評(píng)價(jià)受試藥物的鎮(zhèn)痛作用［14］。在該實(shí)驗(yàn)中，小鼠已經(jīng)表現(xiàn)出上述體征，說明腹腔注射制備的醋酸致疼痛模型是成功的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同給藥劑量的FSC231能夠明顯減少經(jīng)醋酸致痛模型小鼠的扭體次數(shù)，其中高劑量組的作用最為顯著（P＜0.01），同時(shí)還能夠一定程度上延長(zhǎng)小鼠鎮(zhèn)痛潛伏期，增強(qiáng)小鼠對(duì)痛覺的耐受力。

目前針對(duì)PICK1蛋白為靶點(diǎn)的藥物篩選工作已經(jīng)成為藥理研究工作中的一個(gè)熱點(diǎn)，現(xiàn)階段主要是針對(duì)PDZ結(jié)構(gòu)域采用蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法篩選相關(guān)的阻斷性多肽，例如采用酵母雙雜交系統(tǒng)、定向隨機(jī)肽庫(kù)、定向隨機(jī)肽庫(kù)蛋白芯片、噬菌體展示以及時(shí)間分熒光共振能量轉(zhuǎn)移法篩選目的多肽［15］。通過篩選得到的小分子多肽與PICK1的PDZ結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，干擾PICK1生理過程中與配體蛋白的作用，從而發(fā)揮特定的藥用目的。PICK1的另外一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域——BAR結(jié)構(gòu)域如何參加PICK1的生理調(diào)節(jié)的過程研究得比較少，其分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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（編校：吳茜）

Effect of FSC231，an inhibitor of PICK1 on analgesia in m ice

LITie-jun1，GUO Xiao-wen2

（1.Department of Anesthesiology，The Fourth Hospital Affiliated to China Medical University，Jianping 110032，China；2.Department of Anesthesiology，Chinese Medicine Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310006，China）

ObjectiveTo investigate the pharmacological effects of FSC231，the inhibitor of PICK1 through the establishment of acetic acid induced pain model，inflammatory pain model and neuropathic pain model and provide foundation in treatment of clinical pain.Methods40 Kunming miceswere randomly divided into four groups，after the adaptive feeding for a week，and injected 1.4%acetic acid solution in the right hind paw of mice，intraperitoneally of0.6%acetic acid solution in left toe ofmice to prepare acetic acid-induced pain model，injected 20μL complete Freund's adjuvant（CFA）of left toe to prepare inflammatory pain model，injected capsaicin solution of left rear toe to prepare neuropathic pain model：control group and 7.83，39.2，78.4μg／kg FSC231 groups，indictors such as counting palm leg raise times，the inhibition rate，writhing response，incubation period，heat pain threshold，paw swelling volume，the value of TWL and mechanical pain threshold were evaluated after 1h.ResultsCompared with control group，F(xiàn)SC231 could reduce the number of leg raise ofmice with dose-dependentmanner（7.83-78.40）μg／kg in 5min and the number in 6-10 min，and the inhibition rates in 6-10min were 18.74%，32.59%and 45.52%.Compared with control group，different doses of FSC231 could prolong the pain incubation period，butonly the high-dose group's analgesic incubation period were increased significantly（P＜0.05）；FSC231 could reduce the number ofwrithing responses in mice with dose-dependent manner（7.83-78.40）μg／kg，in which the effects of high dose group were the most significant（P＜0.01）.In inflammatory pain models，each rat often lick its affected feet，the majority of affected feet appeared redness，swelling and other inflammatory performance，which showed that inflammatory painmodelswere successfulmade up.After given CFA，the basal pain thresholdswere significantly higher than those of control group（P＜0.05），but the swollen volume of hind legs increased significantly（P＜0.05）.After injected with capsaicin solution in the left hind digit，the TWL and mechanical pain threshold significantly decreased，which showed that neuropathy pain modelweresuccessful prepared.FSC231 could rise TWL and themechanical pain threshold（P＜0.05，P＜0.01）with dose dependentmanner（7.83-78.40μg／kg）.Conclusion FSC231 has obviousanalgesic effect including neuropathic pain，inflammatory pain，and chemical irritation pain.These results suggest that PICK1 plays an important role in inflammatory pain and neuropathic pain.It is a new target for pain relief，suggesting that PICK1 is an important analgesic drug targets.

PICK1；analgesia；CFA；FSC231

R285

A

1005－1678（2014）08－0015－04

2012年浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計(jì)劃（2012KYA141）

李鐵軍，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：臨床麻醉，E-mail：litjun0517＠163.com。