徐 攀 馬 馳 張雪燕 楊曉娟 蔣 丹 聶登梅 劉 昕 韓躍武

目前胃癌臨床治療主要以手術(shù)治療為主，根據(jù)近年來(lái)的臨床調(diào)查結(jié)果顯示[1-2]，中晚期胃癌患者其術(shù)后的生存狀況并不理想，因此早期胃癌的診斷對(duì)患者的療效以及術(shù)后的生存狀況有著重要的意義。本研究通過(guò)建立早期胃癌原代細(xì)胞ssDNA適配子的檢測(cè)方法并進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)其作為診斷早期胃癌標(biāo)準(zhǔn)的診斷性能進(jìn)行分析，旨在建立積極有效且適用于基層醫(yī)院的檢測(cè)方法，為臨床早期胃癌診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究方法[3-6]

1.1.1 早期胃腺癌細(xì)胞表面特異標(biāo)志物(靶物質(zhì))的捕獲、分離 ①早期胃腺癌細(xì)胞表面靶物質(zhì)的分離提取：采取數(shù)例早期胃腺癌組織標(biāo)本，利用原代細(xì)胞分離、純化方法及生物素——鏈酶親和素磁珠方法，分離提取與生物素化的適配子特異性結(jié)合的靶物質(zhì)(即膜分子標(biāo)志物)。②采用層析法分離、純化得到目標(biāo)靶物質(zhì)——分子標(biāo)志物：首先對(duì)上一步提取的靶物質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以正常胃黏膜細(xì)胞膜提取物作為對(duì)照，確定早期胃腺癌原代細(xì)胞靶物質(zhì)的大致分子量。

1.1.2 標(biāo)志物的分析與鑒定 ①應(yīng)用常規(guī)方法確定分子標(biāo)志物化學(xué)屬性(即是糖蛋白、脂蛋白還是糖脂等)：應(yīng)用高碘酸-硝酸銀染色法鑒定電泳凝膠中的糖蛋白；運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行油紅O染色和氨基黑10B染色可以鑒定脂蛋白；采用5-甲基間苯二酚顯色，加熱糖脂可顯出紫紅色。②運(yùn)用電泳、層析及HPLC方法純化5種靶物質(zhì)，確保達(dá)到質(zhì)譜分析所要求的純度：利用質(zhì)譜檢測(cè)，經(jīng)NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋進(jìn)行比對(duì)分析，確定所獲得的分子標(biāo)志物的理論分子量、等電點(diǎn)及結(jié)構(gòu)等基本參數(shù)。

1.1.3 早期胃腺癌診斷方法的建立 ①對(duì)于每一種適配子所捕獲的分子標(biāo)志物進(jìn)行分析，可得到每一種分子標(biāo)志物的相關(guān)參數(shù)，根據(jù)理想腫瘤標(biāo)志物的選擇標(biāo)準(zhǔn)選擇1種標(biāo)志物作為診斷的靶點(diǎn)。②以腫瘤標(biāo)志物建立檢測(cè)方法：根據(jù)標(biāo)志物的屬性，分析其免疫原性，制備單克隆抗體，然后依據(jù)此抗體建立3種檢測(cè)方法：① sp法免疫組化技術(shù)檢測(cè)方法；② 組織裂解免疫發(fā)光的檢測(cè)方法；③ 血清學(xué)檢測(cè)方法建立酶聯(lián)免疫發(fā)光測(cè)定法。

1.1.4 檢測(cè)方法的臨床評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)，以美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織(clinical and laboratory standards institude，CLSI)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，進(jìn)行該方法的性能評(píng)估實(shí)驗(yàn)，主要實(shí)驗(yàn)指標(biāo)包括：敏感性、特異性、陽(yáng)性似然比、陰性似然比、干擾實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)前比和驗(yàn)后比。實(shí)驗(yàn)的診斷性能評(píng)價(jià)，參考《臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)》(ISBN：9787117105811 )，以本項(xiàng)目建立的方法為候選方法，以金標(biāo)準(zhǔn)為參考方法，進(jìn)行方法學(xué)比較。評(píng)價(jià)指標(biāo)包括靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、精確度等。

1.2 主要試劑

膠原酶Ⅳ型、考馬斯亮藍(lán)、高碘酸、硝酸銀、5-甲基間苯二酚均購(gòu)置生工生物工程(上海)股份有限公司；Promega鏈酶親和素磁珠及磁力架購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純，0.5 mol/L EDTA(pH8.0),20%(W/V)Glucose,30%丙烯酰胺，5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，4×SDS-蛋白上樣緩沖液。

1.3 胃癌原代細(xì)胞ssDNA適配子的篩選及優(yōu)化

應(yīng)用0.1%膠原酶Ⅳ型溶液分離得到的早期胃腺癌原代細(xì)胞和正常胃黏膜上皮細(xì)胞純度均在90%以上，篩選前經(jīng)PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，確定了其最佳的退火溫度為46℃，循環(huán)次數(shù)為15次。經(jīng)過(guò)12輪篩選后，得到的ssDNA次級(jí)文庫(kù)與早期胃腺癌的結(jié)合率達(dá)到較高水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 評(píng)價(jià)結(jié)果

以美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織(CLSI)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的敏感性、特異性、陽(yáng)性似然比、陰性似然比、干擾實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)前比和驗(yàn)后比方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示早期胃癌中原代細(xì)胞ssDNA適配子的檢測(cè)敏感性為49.13%，特異性為91.44%，陽(yáng)性似然比為5.74，陰性似然比為0.56 g，干擾實(shí)驗(yàn)51.8%，驗(yàn)前比65.7%，驗(yàn)后比197.2%。

2.2 診斷性能評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)《臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)》，以本項(xiàng)目建立的方法為候選方法，以金標(biāo)準(zhǔn)為參考方法，從靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、精確度方面進(jìn)行比較，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，早期胃癌中原代細(xì)胞ssDNA適配子的檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)相比，在敏感性、特異性、準(zhǔn)確度和精確度方面均無(wú)明顯差異(P>0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 診斷性能評(píng)價(jià)結(jié)果/%

3 討論

ssDNA適配子是運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選所得到的1種寡核苷酸分子，其具有針對(duì)靶物質(zhì)的特異性和較強(qiáng)的親和力[5]，而通過(guò)PCR擴(kuò)增可以使寡核苷酸文庫(kù)中的核酸序列更加豐富，本研究的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)[7]，應(yīng)用膠原酶Ⅳ型溶液能成功分離出原代細(xì)胞，而且純度較高，可以作為1種細(xì)胞分離的方法應(yīng)用于后期研究。利用cell-SELEX技術(shù)能夠針對(duì)早期胃腺癌原代細(xì)胞篩選出特異性的適配子，并且適配子的結(jié)構(gòu)較完整，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能是適配子與靶細(xì)胞結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)采用熒光素修飾適配子的方法能成功的測(cè)定適配子與早期胃腺癌細(xì)胞結(jié)合的特異性和親和力。在測(cè)試的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞株與從組織中分離獲得的細(xì)胞在和適配子結(jié)合的時(shí)候，兩者的熒光強(qiáng)度值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用生物素修飾適配子，結(jié)合鏈霉親和素磁珠分離系統(tǒng)，能夠從早期胃腺癌原代細(xì)胞表面分離出特異的分子標(biāo)志物，得知分子標(biāo)志物的大致分子量，并可以確定細(xì)胞膜分子標(biāo)志物有蛋白質(zhì)成份。在此基礎(chǔ)上我們以美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織(CLSI)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，對(duì)該檢測(cè)方法的敏感性、特異性、陽(yáng)性似然比、陰性似然比、干擾實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)前比和驗(yàn)后比，并與金標(biāo)準(zhǔn)為參考方法，在靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、精確度方面進(jìn)行方法學(xué)比較，其結(jié)果表明早期胃癌原代細(xì)胞ssDNA適配子檢測(cè)方法的敏感性為49.13%，特異性為91.44%，陽(yáng)性似然比為5.74，陰性似然比為0.56 g，干擾實(shí)驗(yàn)51.8%，驗(yàn)前比65.7%，驗(yàn)后比197.2%，并且與金標(biāo)準(zhǔn)相比，在敏感性、特異性、準(zhǔn)確度和精確度方面均無(wú)明顯差異(P>0.05)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此，我們認(rèn)為早期胃癌原代細(xì)胞ssDNA適配子的檢測(cè)，具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性，為早期胃癌的臨床檢測(cè)提供了相應(yīng)的依據(jù)，可考慮作為早期胃癌的輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。

[1] 潘 源，梁 寒，薛 強(qiáng)，等.國(guó)際抗癌聯(lián)盟和日本胃癌協(xié)會(huì)胃癌淋巴結(jié)分期法與國(guó)人胃癌患者預(yù)后相關(guān)性的比較〔J〕.中華腫瘤雜志,2008,30(5):376-381.

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[5] 曹立亭，許李麗，萬(wàn) 向，等.SELEX 技術(shù)中ssDNA 文庫(kù)PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(6)：3241-3242.

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[7] 郭 鵬，習(xí) 靜，張雪燕，等.早期胃腺癌原代細(xì)胞適配子的篩選與鑒定〔J〕.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2013,29(3)：250-256.