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        人參皂苷Rg1通過下調TGFβ1及βigh3表達延緩擬衰老小鼠腎臟纖維化

        2014-09-13 06:25:50金建生陳曉春
        中國老年學雜志 2014年21期
        關鍵詞:小鼠模型

        葉 洪 金建生 陳曉春 張 靜

        (福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院腎內科,福建 福州 350001)

        與衰老相關的研究一直是生命科學領域的研究熱點。腎臟衰老的主要組織學特征是腎小球基底膜增厚、系膜基質增生、節(jié)段性腎小球硬化、腎小管萎縮及腎小管間質纖維化等〔1〕。中藥人參在我國應用已有幾千年的歷史,人參皂苷Rg1作為人參的主要活性成分之一,具有肯定的促智、抗衰老、抗氧化和提高免疫力等作用。研究表明,人參皂苷具有抗腎炎、保護腎功能的作用〔2〕。但該藥物對于腎臟衰老的機制研究較少。本研究通過建立大劑量D-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老模型,觀察人參皂苷Rg1對減輕腎臟衰老的病理變化,并探討其對擬衰老小鼠腎組織纖連蛋白(FN)、轉化生長因子(TGF)β1及β誘導蛋白IG-H3(βigh3)等水平表達的影響。

        1 材料和方法

        1.1實驗動物與分組 清潔級雄性昆明種小鼠78只,均為三月齡,體重30~40 g(購自上海斯萊克公司,合格證號SCXK 滬 2003-0003)。SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。隨機分成六組,每組13只:青年組不進行任何處理,造模開始即留取腎組織;模型組以400 mg·kg-1·d-1的D-半乳糖(上海試劑二廠)進行腹腔注射,而Rg1預防組1~3及科素亞對照組予以D-半乳糖注射的同時另分別給予5、10、20 mg·kg-1·d-1的Rg1(吉林大學基礎醫(yī)學院有機化學教研室提供,純度>98%)腹腔注射,或10 mg·kg-1·d-1的科素亞(杭州默沙東制藥有限公司)灌胃。12 w后,10%水合氯醛0.1 ml/20 g腹腔注射麻醉小鼠后,腹正中切開,原位灌洗,剝離雙腎,取一側腎臟置于新鮮配制的4%多聚甲醛固定24 h(置于4℃冰箱),用于制備石蠟切片;另一側腎臟分成數(shù)塊,部分置于4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH 7.0~7.6)固定2~4 h,20%蔗糖溶液4℃浸泡過夜后,進行冰凍切片,進行SA-β-gal的組織化學染色,其余置于干燥EP管中,液氮冷凍后-80℃凍存,用于超氧化物歧化酶(SOD)檢測及Western印跡。

        1.2藥品和試劑 SOD試劑盒購自日本同仁化學研究所。X-gal為Sigma公司產品。兔抗小鼠FN多克隆抗體購自LAB VISION公司,兔抗小鼠βigh3單克隆抗體購自R&D Systems公司。兔抗小鼠TGFβ1多克隆抗體購自abCAM公司。二抗為羊抗兔試劑,均購自相應公司。

        1.3SA-β-gal染色〔3〕SA-β-gal染色按常規(guī)方法操作,染色后的衰老細胞為靛藍色,顯微鏡下每張切片按順時針方向隨機選取20個視野(×100),結果采用半定量評分:0分:無陽性染色出現(xiàn);1分:偶見小管內有微弱染色;2分:部分小管節(jié)段出現(xiàn)陽性染色;3分:大部分小管出現(xiàn)彌漫性陽性染色,計算每張切片得分的平均值。

        1.4腎組織SOD活力測定 按SOD Assay Kit-WST試劑手冊進行。

        1.5過碘酸雪夫(PAS)染色和腎臟病理分析〔4〕PAS染色按常規(guī)方法操作,光鏡下每張切片按順時針方向隨機選取20個腎小管-間質視野(400倍),行小管-間質損傷評分:0分:腎小管間質無明顯病變;0.5分:小的局灶性的小管間質損傷;1分:皮質區(qū)<10%的小管間質損傷;2分:皮質區(qū)存在10%~25%的小管間質損傷;3分:皮質區(qū)存在25%~75%的小管間質損傷;4分:皮質區(qū)存在≥75%的小管間質損傷,計算每張切片平均值。同時選取20個腎小球(400倍),計算每個小球PAS染色陽性面積和腎小球總面積,求兩者的比值;20個小球此比值的均數(shù)即為每張切片的系膜增生指數(shù)(MMEI)。

        1.6免疫組化方法檢測FN、TGFβ1及βigh3 2 μm石蠟組織切片黏附于多聚賴氨酸黏片劑處理后的載玻片上,經60℃烤片,常規(guī)脫蠟至水,3%過氧化氫室溫孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶,F(xiàn)N、TGFβ1及βigh3 分別以0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)高壓抗原修復,分別滴加一抗(FN 1∶250、TGFβ1 1∶100、βigh3 1∶100)4℃孵育過夜后,以二抗(羊抗兔)37℃孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素染核,分化、返藍、脫水、透明、封片。每組染色均設以PBS代替一抗作陰性對照。取染色后的切片,在高倍鏡(200~400倍) 下隨機選擇20個腎小球視野或20個腎小管-間質視野,根據染色強度和面積,按下列方法進行半定量評分,染色強度標準: 基本不著色者0分,著色淡者(低倍鏡下可疑陽性,高倍鏡下明確陽性)1分,適中者(低倍鏡下明確陽性)2分,深者(低倍鏡下強陽性)3分;染色面積標準:0分:無染色或微弱染色,1分:染色面積<25%,2分:染色面積在25%~50%之間,3分::染色面積在50%~75%之間,4分:染色面積> 75%。將染色強度與染色面積得分相乘,所得分數(shù)為該例的陽性積分。每組陽性總積分除例數(shù)等于各組的平均陽性積分。

        1.7Western印跡檢測TGFβ1及βigh3 取腎組織加裂解液后勻漿,離心,取上清,測蛋白濃度。加蛋白上樣液于10%+十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電轉移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%無脂奶粉封閉,加一抗TGFβ1(1∶2 000)、βigh3(1∶2 000)孵育4℃過夜。含0.1%吐溫PBS洗膜,辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG中孵育1 h,洗膜,以化學發(fā)光法顯示結果。采用Alpha EmagerTM 2200凝膠成像及分析系統(tǒng),于可見光下采集底片上的蛋白條帶圖像,通過與相應β-actin條帶密度比較,計算各條帶密度相對值。

        2 結 果

        2.1一般情況 青年組的小鼠毛色白,其富含光澤,行動和反應情況靈敏。實施造模的1個月之后,各組小鼠均出現(xiàn)程度各異的皮毛粗糙和發(fā)黃,且精神萎靡,相關行動較為遲緩,且不喜活動,以模型組情況最為顯著。而以Rg1實施預防的各組整體情況均優(yōu)于模型組,其中Rg1 劑量為20 mg·kg-1·d-1時最優(yōu)。

        2.2衰老相關β-半乳糖苷酶染色 各組SA-β-gal染色陽性的細胞均定位于腎小管,腎小球中鮮有表達。與青年組相比,模型組及各預防組染色陽性細胞均顯著增加(均P<0.01)。與模型組相比,Rg1 20 mg·kg-1·d-1組與科素壓組衰老細胞均顯著減少(均P<0.01)。見圖1,表1。

        2.3腎組織SOD活力測定 與青年組相比,模型組及各預防組腎臟SOD活力均顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,各預防組SOD活力均有不同程度回升(均P<0.01),以Rg1 20 mg·kg-1·d-1預防組效果最明顯。后者與Rg1 10 mg·kg-1·d-1組及科素亞組相比,有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

        表1 各組小鼠衰老相關性指標的情況對比±s,n=13)

        圖1 各組小鼠SA-β-gal染色(×100)

        2.4PAS染色鏡下觀察 建模12 w,模型組可見腎小球肥大,系膜增生,節(jié)段性腎小球硬化,基底膜增厚以及局灶性小管間質損傷,炎性細胞浸潤,小管擴張、萎縮、壞死等。Rg1 20 mg·kg-1·d-1預防組與科素亞組能顯著減輕腎小管間質病變及小球系膜增生(均P<0.01)。在改善腎小管間質損傷方面,Rg1 20 mg·kg-1·d-1預防組與科素亞組相比差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05);在減輕小球系膜基質增生程度上,Rg1 20 mg·kg-1·d-1預防組不如科素亞組(P<0.05)。見表2,圖2。

        表2 各組小鼠腎臟病理改變狀況±s,n=8)

        2.5腎組織FN、TGFβ1以及βigh3的表達 FN主要定位于腎小球系膜基質,腎小管間質亦有少量表達。TGFβ1、βigh3主要分布于腎小管上皮細胞和基底膜,而腎小球中僅有微量表達。模型組腎小球及腎小管陽性染色顯著增多。各預防組可見不同程度的表達降低。見圖3~圖5,表3。

        2.6Western印跡法檢測腎皮質TGFβ1、β igh3蛋白相對表達量 單次檢測后,青年組中TGFβ1、β igh3僅有微量表達,模型組TGFβ1、β igh3蛋白水平明顯升高??扑貋喗M和Rg1干預組TGFβ1、β igh3蛋白水平顯著下降,見圖6。

        表3 各組小鼠的腎組織FN和TGFβ1以及βigh3染色平均陽性積分比較±s,n=13)

        圖2 各組小鼠腎臟PAS染色(×400)

        圖3 各組大鼠腎臟FN表達及部位(×400)

        圖4 各組大鼠腎臟TGFβ1表達及部位(×400)

        圖5 各組大鼠腎臟βigh3表達及部位(×200)

        A:青年組;B:模型組;C:Rg1 5mg/kg/d組;D:Rg1 10mg/kg/d組;E:Rg1 20mg/kg/d組 F:科素亞組

        2.7相關性分析 腎小管上皮細胞TGFβ1陽性信號與SA-β-gal染色陽性信號呈顯著正相關(r=0.756,P<0.01)。βigh3與TGFβ1染色陽性積分呈顯著正相關(r=0.927,P<0.01)。

        3 討 論

        現(xiàn)代藥理學認為,人參中富含多類化學成分,如皂苷和多肽以及有機酸和脂溶性成分等,尤以人參皂苷的作用顯著〔5〕。在多類實驗型腎病模型中,均可表明人參皂苷具有較好的腎保護效果,其可不同程度上緩解膜性腎病模型中的腎小管間質性損傷和細胞中線粒體腫脹,以及足突融合和基底膜增厚〔6〕。有學者在研究中還發(fā)現(xiàn)〔7〕,人參皂苷能夠啟動機體近曲小管的上皮細胞有關DNA復制從而修復由慶大霉素導致的腎小管組織壞死而達到治療效果。

        本研究結果提示人參皂苷Rg1可能通過抗氧化機制來發(fā)揮其對抗腎臟衰老的作用。究其原因,認為這可能是因為Rg1抗氧化作用可能是腎臟保護相關作用的主要機制〔8〕。Rg1通過提升機體的抗氧化能力,同時可清除已形成的氧自由基,抑制有關細胞的凋亡,以及調控血管活性類物質達到延緩衰老的目的〔9〕。應用不同劑量人參皂苷Rg1可緩解腎小球FN的沉積,同時下調小鼠腎小管上皮細胞TGFβ1和βigh3等蛋白的表達,以20 mg Rg1預防組最為明顯。此外,20 mg Rg1預防組雖可顯著緩解對于腎小管間質的損傷,但在減少腎小球系膜基質的增生程度上,不如科素亞組。人參皂苷Rg1可能對于擬衰老過程腎臟損傷具有一定的保護作用。FN和TGFβ1以及βigh3水平下調亦有可能是人參皂苷Rg1減緩腎臟的衰老機制之一〔10〕。其中的TGFβ主要是一種對細胞的生長分化進行調節(jié)的重要因子,其過度形成能導致不可逆的機體組織纖維化,其中以TGFβ1和組織纖維化擁有最為緊密的聯(lián)系〔11〕。有報道稱〔12〕,TGFβ1對于機體成纖維細胞以及單核細胞均有一定趨化作用,其在腎臟的衰老過程內,通常隨著年齡增加而表達水平上升。TGFβ1通常定位在腎小管細胞及間質細胞,同時,SA-β-gal染色呈陽性的細胞亦主要定位在腎小管,少見于腎小球,相關分析發(fā)現(xiàn),SA-β-gal染色與TGFβ1表達呈明顯的正相關,這表明衰老小管細胞有可能為TGFβ1蛋白表達的一個主要來源。FN作為TGFβ1效應分子,其在模型組的腎小球中沉積顯著增大,但其他各Rg1預防組均可減少FN表達,以Rg1 20 mg·kg-1·d-1的效果最佳,這可能是因為Rg1通過下調機體TGFβ1表達水平來糾正發(fā)生于細胞外基質的非正常代謝,從而緩解腎臟纖維化程度〔13〕。近年來研究認為βigh3為TGFβ1下游分子,能夠作為TGFβ1的一種活性指標。Li等〔14〕報道,βigh3可參與到細胞間黏附和遷移及增殖分化和信息傳遞過程,在正常腎組織內,其表達部位常局限在腎臟近端的腎小管基底膜,但在腎小球旁器血管成分細胞中亦有βigh3的表達,這亦提示βigh3可能在所介導的腎小球硬化及間質纖維化等過程內發(fā)揮出重要作用,符合本文的報道結果。

        4 參考文獻

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