何展文 李棟方 劉木金 孟 哲 李平甘 羅向陽(yáng) 梁立陽(yáng) 李文益

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

炎癥性脫髓鞘疾病是一種基因、病毒感染、環(huán)境等多因素相互作用引起的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，外源的病毒感染后可激活淋巴細(xì)胞引起特異性免疫應(yīng)答，病毒的抗原決定簇與髓鞘抗原相似，導(dǎo)致交叉免疫反應(yīng)，從而攻擊自身的髓鞘組織。目前應(yīng)用于炎癥性脫髓鞘疾病的自身免疫性腦脊髓炎(EAE)動(dòng)物模型主要以髓鞘堿性蛋白(MBP)、豚鼠腦脊髓組織勻漿(BSCH)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)或其多肽片段、髓鞘素(myelin)等作為免疫抗原。研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)EAE特異性致敏抗原刺激后淋巴細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)作用，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道并不多見(jiàn)〔1〕。本實(shí)驗(yàn)擬了解體外異種大鼠BMSCs對(duì)MBP68-86抗原刺激后淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用，為BMSCs對(duì)EAE的免疫調(diào)節(jié)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胰蛋白酶購(gòu)置上海吉泰科技有限公司。FITC小鼠IgG1購(gòu)自BD pharmingen公司；小鼠抗大鼠CD44、PE抗大鼠CD3、PE小鼠IgG1、PE抗大鼠CD4、PE抗大鼠CD8、PE抗小鼠或大鼠CD25購(gòu)自Serotec公司；FITC抗大鼠CD90、PE抗大鼠CD106、PE抗大鼠CD45、PE小鼠IgG2a、PE抗大鼠CD11b/c、PE Armenlan Hamster和PE抗小鼠或大鼠CD29購(gòu)自 Biolegend公司；CD34 PE購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。ConA購(gòu)自 sigma公司，MBP68-86(bs-0380p)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。完全佐劑購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司。綠色熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司。IFN-γ、TGF-β1和 IL-10ELISA試劑盒購(gòu)自上海麥約爾生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠，180～220 g左右，購(gòu)自廣東省南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)所合格證2006-0015號(hào)。健康SD大鼠，200 g左右，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)所合格證2008-0002號(hào)。

1.3BMSCs的分離培養(yǎng)和表型鑒定 斷頸處死Wistar大鼠，放置超凈臺(tái)上，剪開(kāi)大鼠后肢皮膚，充分暴露剝離腿部肌肉，取出股骨和脛骨。剪去其兩端骨骺，于10 cm2培養(yǎng)皿內(nèi)使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓。用BMSCs完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打使之形成單細(xì)胞懸液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)。貼壁3 d后換液，每隔3 d換液直至傳代，待細(xì)胞80%～90%融合的時(shí)候傳代，第4代(P4)用于實(shí)驗(yàn)。用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞移入離心管中，1 100 r/min離心4 min，棄去上清。加磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液重懸細(xì)胞，吸取100 μl細(xì)胞懸液(約3.0×105個(gè)細(xì)胞)加入EP管內(nèi)。按量加入與PE或FITC標(biāo)記的IgG1、CD34 、CD44、CD45、CD11b/c、CD29、CD90、CD105單克隆抗體，避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.4脾臟單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)的制備和標(biāo)記 (1)無(wú)菌條件下取出SD大鼠脾臟，PBS洗滌，剪碎，放入研磨器研磨，收集細(xì)胞懸液，過(guò)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，制成細(xì)胞懸液。(2)經(jīng)Tris-NH4Cl緩沖液裂解紅細(xì)胞，PBS后滌2次后收獲單個(gè)核細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)備用。(3)用含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞混懸濃度至1×107個(gè)/ml，每毫升細(xì)胞懸液加入5 μl CFSE，終濃度為5 μmol/L，37℃孵育 15 min。(4)用等體積小牛血清終止10 min，PBS洗滌3次后用完全培養(yǎng)基將染色后的細(xì)胞稀釋到1×106個(gè)/ml備用，洗滌及離心過(guò)程中注意避光。

1.5方法

1.5.1分組 (1)將MNCs細(xì)胞混懸液加入96孔板中，細(xì)胞數(shù)每孔2×105個(gè)/孔。(2)加入不同濃度BMSCs和空白對(duì)照，使BMSCs與MNCs細(xì)胞的比例分別為1∶10、1∶20和1∶40。每孔分別加入終濃度為ConA 5 μg/ml，MBP 68～865 μg/ml和無(wú)抗原刺激。(3)每組實(shí)驗(yàn)做3復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)孵育96 h。

1.5.2淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 收集培養(yǎng)細(xì)胞，用抗CD4-PE作細(xì)胞表面分子染色，以CFSE為第一熒光(FL1)，PE標(biāo)記抗體為第二熒光(FL2)，用CellQuest PRO軟件獲取數(shù)據(jù)，Modfit軟件分析淋巴細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞分裂指數(shù)(CDI)采用刺激后CFSE熒光強(qiáng)度減弱的細(xì)胞百分比與未采用刺激后培養(yǎng)熒光強(qiáng)度減弱細(xì)胞百分比的比例。

1.5.3細(xì)胞上清血細(xì)胞因子檢測(cè) 細(xì)胞與抗原刺激劑共孵育后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。通過(guò)ELISA 方法檢測(cè)干擾素(IFN)-γ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1和白介素(IL)-10的含量。操作按說(shuō)明書(shū)(上海麥約爾生物科技有限公司) 進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs分離與培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞接種第3天，部分貼壁生長(zhǎng)，多呈長(zhǎng)梭形、三角形和多角形，即為BMSCs；第7～12天開(kāi)始增長(zhǎng)明顯加快，具有一定的方向性，呈束狀或放射狀排列；第14天左右，單種細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞貼壁率達(dá)90%。傳代培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)多為長(zhǎng)梭形，較原代細(xì)胞體積增大，增殖速度加快，貼壁能力增強(qiáng)，約7 d左右貼壁率達(dá)80%～90%。見(jiàn)圖1。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠BMSCs的表型情況 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第4代Wistar大鼠的BMSCs表型，強(qiáng)表達(dá)CD29、CD44和CD90，少量表達(dá)CD34和 CD106，幾乎不表達(dá)CD11b和CD45。

2.3淋巴細(xì)胞增殖能力情況

2.3.1ConA刺激后淋巴細(xì)胞增殖情況 ConA刺激后MNCs和不同數(shù)量BMSCs共培養(yǎng)96 h后，無(wú)BMSCs的情況下ConA作用下MNCs細(xì)胞在直方圖上出現(xiàn)多個(gè)子峰，熒光強(qiáng)度依次減半，可見(jiàn)分裂2代和3代的細(xì)胞；而未刺激對(duì)照組熒光強(qiáng)度保持不變?nèi)詾閱畏?。BMSCs共培養(yǎng)的情況下ConA作用下MNCs細(xì)胞在直方圖上出現(xiàn)也可見(jiàn)多個(gè)子峰，熒光強(qiáng)度依次減半，可見(jiàn)分裂2代和3代的細(xì)胞。進(jìn)一步分析MNCs各子代細(xì)胞所占百分率，發(fā)現(xiàn)BMSCs與MNCs共培養(yǎng)后的細(xì)胞親代百分率較無(wú)BMSCs存在的情況下的細(xì)胞親代百分率明顯增多，且隨著B(niǎo)MSCs數(shù)量增多，細(xì)胞親代百分率越高，表明其淋巴細(xì)胞增殖分裂受到抑制，且有劑量依賴性。見(jiàn)表1。

×100

表1 MNCs親代細(xì)胞和子代細(xì)胞百分率變化±s，n=3，%)

2.3.2MBP68-86刺激后淋巴細(xì)胞增殖情況 MBP68-86刺激后MNCs和不同數(shù)量BMSCs共培養(yǎng)96 h后，無(wú)BMSCs的情況下MBP68-86作用下MNCs細(xì)胞在直方圖上出現(xiàn)多個(gè)子峰，熒光強(qiáng)度依次減半，可見(jiàn)分裂2代和3代的細(xì)胞；而未刺激對(duì)照組熒光強(qiáng)度保持不變?nèi)詾閱畏?。BMSCs共培養(yǎng)的情況下MBP68-86作用下MNCs細(xì)胞在直方圖上同樣出現(xiàn)也可見(jiàn)多個(gè)子峰，熒光強(qiáng)度依次減半，可見(jiàn)分裂2代和3代的細(xì)胞。進(jìn)一步分析MNCs各子代細(xì)胞所占百分率，發(fā)現(xiàn)BMSCs與MNCs共培養(yǎng)后的細(xì)胞親代百分率較無(wú)BMSCs存在的情況下的細(xì)胞親代百分率明顯增多，且隨著B(niǎo)MSCs數(shù)量增多，細(xì)胞親代百分率越高，表明BMSCs能抑制MBP68-86刺激的淋巴細(xì)胞增殖，且有劑量依賴性。見(jiàn)表2。

表2 MNCs親代細(xì)胞和子代細(xì)胞百分率變化±s，n=3)

2.4各組細(xì)胞上清中IFN-γ、TGF-β1和IL-10的表達(dá)情況

2.4.1細(xì)胞上清IFN-γ表達(dá)分析 ConA刺激MNCs細(xì)胞后，IFN-γ表達(dá)明顯上升(P<0.05)；BMSCs共培養(yǎng)的情況下，IFN-γ表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而且隨著B(niǎo)MSCs劑量增加，IFN-γ下降越明顯(P<0.05)。MBP68-86刺激MNCs細(xì)胞后，IFN-γ表達(dá)明顯上升(P<0.05)；BMSCs共培養(yǎng)的情況下，IFN-γ表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而且隨著B(niǎo)MSCs劑量增加，IFN-γ下降越明顯(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞上清中IFN-γ表達(dá)情況±s,n=3)

2.4.2細(xì)胞上清TGF-β1表達(dá)分析 ConA刺激MNCs細(xì)胞后，TGF-β1表達(dá)有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；BMSCs共培養(yǎng)的情況下，TGF-β1表達(dá)升高，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。MBP68-86刺激MNCs細(xì)胞后，TGF-β1有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；BMSCs共培養(yǎng)的情況下，TGF-β1的表達(dá)升高，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞上清中TGF-β1表達(dá)情況±s,n=3)

2.4.3細(xì)胞上清IL-10表達(dá)分析 ConA刺激MNCs細(xì)胞后，IL-10表達(dá)明顯下降(P<0.05)；BMSCs共培養(yǎng)的情況下，IL-10表達(dá)升高，且MNCs與BMSCs的比值為1∶20和1∶40時(shí)IL-10的升高有顯著性差異(P<0.05)。MBP68-86刺激MNCs細(xì)胞后，IL-10表達(dá)明顯下降(P<0.05)；BMSCs共培養(yǎng)的情況下，IL-10表達(dá)升高，當(dāng)MNCs與BMSCs的比值為1∶20和1∶40時(shí)IL-10的升高有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞上清中IL-10表達(dá)情況±s,n=3)

3 討 論

炎癥性脫髓鞘疾病的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前被普遍接受的觀點(diǎn)認(rèn)為，炎癥性脫髓鞘疾病等是在易感基因的基礎(chǔ)上，受環(huán)境因素的觸發(fā)由T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病〔2〕。證據(jù)顯示在炎癥性脫髓鞘疾病動(dòng)物模型EAE中，自身反應(yīng)性T細(xì)胞通過(guò)對(duì)MBP或PLP的攻擊產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，同時(shí)髓鞘特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化和克隆增殖是誘導(dǎo)EAE的必要條件〔3〕。既往研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs免疫原性很弱，在體外不但不能誘發(fā)免疫應(yīng)答，而且還具有抑制免疫反應(yīng)的作用〔4，5〕。

傳統(tǒng)的檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖能力的方法有同位素3H 標(biāo)記胸腺嘧啶(3H2TdR) 法、四甲基偶氮唑鹽 (MTT) 法等。但該些檢測(cè)方法存在許多不足之處，如敏感性不高、有放射性危害、所用儀器昂貴，而且這些方法提供的信息非常有限，不能反映不同淋巴細(xì)胞亞群的增殖狀態(tài)。Lyons等〔5〕利用CFSE標(biāo)記細(xì)胞與流式細(xì)胞儀相結(jié)合技術(shù)來(lái)檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，建立了一種功能強(qiáng)大的細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs不僅對(duì)非特異性抗原ConA刺激MNCs增殖有抑制作用，而且對(duì)特異性抗原MBP68-86刺激MNCs同樣有抑制作用。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示BMSCs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖抑制作用有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著劑量增加，BMSCs對(duì)淋巴細(xì)胞細(xì)胞增殖的抑制作用則增強(qiáng)，與Aggarwal等〔6〕的研究結(jié)果相似。不少研究證實(shí)BMSCs在體外實(shí)驗(yàn)的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以及應(yīng)用CD3或CD28抗體刺激的淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中均能抑制淋巴細(xì)胞的增殖，其中對(duì)CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的增殖抑制作用最顯著〔7～9〕。而且Sun等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)同種、異種或第三者小鼠BMSCs均能夠抑制異體T細(xì)胞刺激的淋巴細(xì)胞的增殖，并且發(fā)現(xiàn)第三者BMSCs比自體BMSCs具有更強(qiáng)的抑制效果。本研究表明體外異種大鼠BMSCs能抑制MBP抗原刺激后MNCs增殖，為BMSCs對(duì)EAE的免疫調(diào)節(jié)作用奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

BMSCs免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為可能通過(guò)與免疫細(xì)胞直接接觸或通過(guò)改變細(xì)胞因子分泌網(wǎng)絡(luò)間接影響免疫細(xì)胞來(lái)發(fā)揮效應(yīng)，但確切機(jī)制仍不清楚。研究顯示IFN-γ、IL-10和TGF-β1在BMSCs抑制細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用〔11〕。本研究結(jié)果表明BMSCs對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的抑制和促進(jìn)作用與BMSCs呈一定劑量依賴關(guān)系。BMSCs可能通過(guò)下調(diào)IFN-γ的表達(dá)，上調(diào)IL-10和TGF-β1的表達(dá)，在體外抑制非特異性抗原ConA和特異性抗原MBP刺激下淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，提示BMSCs可能通過(guò)自分泌或調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)，從而抑制特異性抗原所致的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，因而推測(cè)BMSCs對(duì)EAE大鼠模型中的免疫損傷可能具有免疫抑制作用。

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