何 敏 舍雅莉 侯 茜 郭 美 王 嵐 張 帆

(甘肅中醫(yī)學院系統(tǒng)生物學與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所 中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學科重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

中藥黨參是我國常用的傳統(tǒng)補益藥，其藥理學功能有延緩衰老，抗氧化，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，影響免疫器官的重量，調(diào)控細胞因子，降低血脂，調(diào)節(jié)體液免疫，促進淋巴細胞增殖，影響單核巨噬細胞，促進造血功能等〔1，2〕。有研究表明甘肅黨參水提物可能通過提高機體免疫功能,清除衰老機體產(chǎn)生過多的自由基，抗脂質(zhì)過氧化而起到延緩衰老的作用〔3〕。本實驗研究甘肅黨參水煎劑對D-半乳糖致衰老小鼠脾臟細胞抗氧化和DNA損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 昆明種小鼠60只，雄性，體重(20±2)g，SPF級，由甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心提供。

1.2藥品與試劑與儀器 黨參：素花黨參(甘肅文縣產(chǎn)，由甘肅中醫(yī)學院藥學系靳玲副教授鑒定)，制成含生藥濃度為1 g/ml的水煎劑,置4℃?zhèn)溆?。D-半乳糖：上海中秦有限公司(批號：20120104)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號：分別為A 001-1、A 005、A 002南京建成生物工程研究所提供)。PI染液、正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖，1%月桂酸肌氨酸鈉、蛋白酶K、Tris、均購自美國Sigma公司；Na2EDTA購自瑞士Fluka &RDH 公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Feb-80臺式高速離心機：金壇市恒豐儀器廠；756 MC型分光光度計：上海第三分析儀器廠；水浴箱(ZHWY-110X30)，電泳槽和電泳儀：(BIO-RAD)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS-IX51)。

1.3方法 60只小鼠，隨機分為正常組，模型組，黨參低劑量、高劑量組，維生素E組，每組12只。正常組皮下注射0.9%生理鹽水0.25 ml/10 g，其余各組每日頸背部皮下注射5%D-半乳糖0.25 ml/10 g，連續(xù)注射10 d。于第11天開始(每天繼續(xù)注射D-半乳糖)黨參低、高劑量組每日給予黨參水煎劑5，15 g/kg灌胃，正常組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，維生素E組每日維生素E 50 mg/kg灌胃，再連續(xù)給藥32 d。

1.4脾臟組織SOD、GSH-Px、MDA測定 于末次給藥的次日，頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，稱體重，脾臟組織加9倍體積的冰生理鹽水，制成10%脾臟組織勻漿，然后(3 000～4 000)r/min離心10 min，取適量上清液采用黃嘌呤氧化酶法測定脾臟組織中總SOD活性，用5,5，-二硫?qū)?-硝基苯甲酸(DTNB)法測定GSH-Px的活力，硫代巴比妥酸法檢測脾臟組織中MDA活性，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.5脾細胞懸液的制備 頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取脾臟組織放于含適量冰冷的PBS的平皿內(nèi)，用眼科剪剪成糜狀(約1 mm3組織塊)，200目尼龍網(wǎng)過濾，收集細胞懸液，將細胞濾液1 600 r/min離心5 min，用PBS重新懸浮離心管低的細胞，并調(diào)整細胞密度。用4%的臺盼藍排斥法檢測細胞活力，細胞存活率接近90%，細胞密度為105～106個/ml。細胞吹打均勻后，向每個2.0 ml的離心管中各加400 μl脾細胞，在37℃水浴中孵育60 min。

1.6單細胞凝膠電泳 鋪第一層膠：常規(guī)載玻片打磨，自來水清洗，泡酸過夜，自來水，雙蒸水清洗烘干備用。取50 ℃以上，1%的正常熔點的膠50 μl/片給備好的磨片鋪第一層膠備用。鋪第二層膠：取孵育好的細胞和40℃、1.2 ml 1%的低熔點的膠各400 μl吹打均勻放在37℃水浴箱水浴，將上述兩種液體各取1.4 ml，制成混懸液均勻的鋪在備好的膠片上，室溫下靜止3～4 min。裂解：將凝膠浸入4℃預(yù)冷的裂解液中，放在4℃冰箱1 h后移入37℃、CO2培養(yǎng)箱過夜。電泳：從裂解液中移出載玻片，用pH 8.5的TBE漂洗3次，每次30 min，在第3次漂洗時將4℃預(yù)冷的TBE加入電泳槽，靜止20～30 min后，將漂洗好的玻片移入電泳槽里，隨后在相同電泳液中以電壓25 V，電流300 mA，室溫避光條件下電泳30 min。固定：電泳完成后取出玻片移入暗盒，加1%的H2O2固定10 min后，用蒸餾水漂洗3次，每次3 min。染色：用5 μg/ml PI染液染色30 min，雙蒸水洗掉表面的染料，24 h內(nèi)在倒置熒光顯微鏡20倍物鏡下進行觀察，照相，激光波長488 nm。

1.7統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1甘肅黨參水煎劑對脾臟細胞的抗氧化作用 模型組小鼠SOD、GSH-Px活性顯著低于正常組(P<0.01)。甘肅黨參水煎劑高劑量組、維生素E組與模型組相比SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.01，P<0.05),MDA含量顯著降低(P<0.01)。黨參低劑量組無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2甘肅黨參水煎劑對脾臟細胞DNA損傷的影響 模型組小鼠脾細胞的尾距和尾部DNA含量顯著高于正常組(P<0.01)。甘肅黨參水煎劑高劑量組、低劑量組、維生素E組與模型組相比小鼠脾細胞的尾距和尾部DNA含量顯著降低(P<0.01)，見表1。

表1 甘肅黨參水煎劑對D-半乳糖致衰老小鼠脾臟組織SOD、GSH-Px活性、MDA含量及脾臟細胞DNA損傷的影響(n=12,±s)

3 討 論

機體衰老的分子機制包括諸多因素,而自由基的損傷在衰老機制的研究中占有一定的地位。機體自由基學說認為引起人體衰老的主要原因是人體細胞代謝過程中不斷產(chǎn)生自由基，自由基在體內(nèi)積累過多，過剩的自由基就會使類脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，從而破壞細胞的膜結(jié)構(gòu)，使膜功能失常，導致細胞死亡。同時脂質(zhì)過氧化過程的延伸階段產(chǎn)生脂過氧自由基LOO·、脂氧自由基LO·、和脂自由基L·、終止階段產(chǎn)生的小分子丙二醛等，均可對DNA造成損傷〔4〕，有資料表明：DNA隨年齡的增長，損傷增加，修復(fù)能力減弱〔5〕，引發(fā)DNA損傷的因素很多，DNA分子在環(huán)境中的X線、紫外線、化學藥品等及體內(nèi)自由基等因素作用下均可受到損傷。而體內(nèi)氧化-還原反應(yīng)的代謝產(chǎn)物氧自由基(OH)就是其中主要因素之一。因此，尋找能清除氧自由基，并能保護DNA損傷的有效物質(zhì)，以保護DNA雙鏈完整性，防止基因突變，亦是現(xiàn)在延緩衰老以及防治某些疾病特別是防治腫瘤中一個新的研究方向。

單細胞凝膠電泳實驗(SCGE) 或稱彗星試驗〔6，7〕，是一種直接在熒光顯微鏡下用肉眼觀察單個細胞DNA鏈斷裂的試驗方法。在堿處理和堿性電泳的作用下DNA解螺旋,使DNA的斷鏈和堿易變性DNA片段從嚴密的超螺旋結(jié)構(gòu)中釋放出來；由于這些DNA斷鏈分子量小且堿變性為單鏈，所以在電泳電場中就可以離開核DNA在凝膠分子篩中向陽極移動，產(chǎn)生一個尾狀帶，未損傷的DNA部分保持球形，二者共同形成“彗星”。在一定范圍內(nèi)，“彗星”的長度(代表DNA遷移距離)和經(jīng)熒光染色后“彗星”熒光強度(代表DNA的量)與DNA損傷程度相關(guān)，這樣就可以定量檢測單個細胞中的DNA損傷〔8，9〕，進而反映整個細胞、組織、器官內(nèi)DNA整體損傷程度的大小。

D-半乳糖連續(xù)誘導的亞急性衰老小鼠模型較為公認，可以用于行為學、抗氧化以及免疫學等方面的抗衰老藥物藥效的研究〔10～12〕。本實驗研究說明甘肅素花黨參水煎劑能使衰老小鼠脾臟細胞SOD，GSH-Px活力增強，MDA含量降低，并且有效減少DNA的損傷。因此，甘肅素花黨參水煎劑能增強D-半乳糖致衰老小鼠脾臟細胞抗氧化能力及保護DNA的作用。

4 參考文獻

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12朱亞珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老動物模型的建立及其檢測方法〔J〕.復(fù)旦學報:醫(yī)學版，2007；34(4)：617-9.