李春花 周 磊

(吉林省人民醫(yī)院內分泌科，吉林 長春 130021)

糖尿病腎病(DN)已經(jīng)超過高血壓腎病成為我國終末期腎病的第二位病因〔1〕。目前現(xiàn)有的臨床治療方法難以完全阻斷DN進展，因此迫切需要深入研究其機制以開發(fā)新的治療方法。白藜蘆醇是一種從植物中提取的多酚醇類物質，是沉默信息調節(jié)子(SIRT)1的天然激活劑。現(xiàn)有大量研究證明，其對糖尿病的多種并發(fā)癥具有良好的治療作用，但機制尚不完全清楚〔2〕。SIRT1作為三級組蛋白去乙?；?，其活性變化可影響線粒體代謝和功能〔3〕。本研究觀察白藜蘆醇干預后DN大鼠腎組織中線粒體分裂、融合基因轉錄水平變化和線粒體膜電勢變化，探討其對腎臟的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性Wistar大鼠45只，體重(200±20)g。隨機分為對照組、DN組和白藜蘆醇治療組(RSV組)各15只。

1.2試劑與儀器 RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，PCR試劑盒購自北京天根公司，白藜蘆醇購自美國Sigma公司，組織線粒體提取試劑盒購自美國Thermo公司，線粒體膜電勢檢測試劑盒JC-1購自上海碧云天生物技術有限公司，全自動生化分析儀為日本Olympus公司產品。

1.3建立DN大鼠模型 參考文獻〔4〕進行少量修改，建立2型DN大鼠模型。健康Wistar大鼠，高脂飲食，腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg建立2型糖尿病模型(空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖++以上)，繼續(xù)喂養(yǎng)12 w，根據(jù)血尿生化學檢測、組織形態(tài)學檢測，確立DN大鼠模型建立成功。

1.4給藥方法 對照組和DN組生理鹽水5 ml·kg-1·d-1灌胃。RSV組白藜蘆醇20 mg·kg-1·d-1灌胃。均連續(xù)給藥12 w，于治療結束后，收集24 h尿標本，腹腔麻醉，取血標本和腎組織標本。

1.5檢測指標 生化分析法檢測血糖，酶聯(lián)免疫法測定24 h尿白蛋白排泄率，肌酐清除率。

1.6線粒體分裂、融合基因轉錄水平表達變化 提取大鼠腎組織總RNA，分光光度計測定RNA質量和濃度。實時多聚酶鏈反應(RT-PCR)法檢測線粒體融合基因Mfn1、Mfn2和線粒體分裂基因Fis1、Drp1 mRNA表達變化。引物及PCR反應條件見參考文獻〔5〕。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后，天能凝膠成像系統(tǒng)成像保存。

1.7線粒體膜電勢檢測 按照線粒體提取試劑盒說明書，從新鮮腎組織中提取完整線粒體，用線粒體膜電勢檢測試劑盒(JC-1)染色線粒體，流式細胞儀最大激發(fā)波長為514 nm，最大發(fā)射波長為529 nm檢測。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組空腹血糖的比較 對照組空腹血糖(5.13±0.62)mmol/L，DN組(24.55±2.16)mmol/L,RSV組(21.74±5.34)mmol/L。DN組和RSV組血糖無明顯差異(P>0.05)。

2.2各組肌酐清除率和24 h尿白蛋白的比較 對照組肌酐清除率(0.13±0.02)ml·min-1·100 g-1，DN組(0.37±0.07)ml·min-1·100 g-1，RSV組(0.19±0.05)ml·min-1·100 g-1。與DN組相比，RSV組明顯降低(P<0.05)。對照組24 h尿白蛋白(1.93±0.42)mg/24 h，DN組(15.12±3.47)mg/24 h，RSV組(7.04±2.32)mg/24 h。與DN組相比，RSV組明顯降低(P<0.05)。

2.3各組腎臟組織中線粒體動態(tài)變化平衡的影響 與對照組相比，線粒體融合基因Mfn1、Mfn2和線粒體分裂基因Fis1、Drp1在DN組均有不同程度增高，但其中Mfn2表達變化不明顯。與DN組相比，RSV組Mfn1、Fis1降低明顯(P<0.05)，而Drp1雖有所降低，但程度變化較小(見表1和圖1)。

表1 3組Mfn1、Mfn2、Fis1、Drp1mRNA表達的密度掃描(n=3,±s)

圖1 各組Mfn1、Mfn2、Fis1和Drp1的RT-PCR結果

2.4各組腎臟組織中線粒體膜電勢的影響 與對照組(100.0%)相比，DN組、RSV組線粒體膜電勢均有降低(P<0.05)。與DN組(60.24%±7.11%)相比，RSV組(83.04%±9.17%)明顯增高(P<0.05)。

3 討 論

糖尿病是慢性代謝性疾病，其發(fā)病率在全世界范圍內呈持續(xù)增長勢頭。糖尿病患者長期的高血糖狀態(tài)是促進血管病變和功能障礙的根本因素，引起多種糖尿病并發(fā)癥，是糖尿病患者主要的致殘致死原因。老年患者是慢性代謝性疾病和心血管疾病的高發(fā)人群。在臨床治療中，血糖穩(wěn)態(tài)控制的困難及腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑治療難以完全阻斷腎病進展。SIRT1作為代謝相關疾病治療研究的熱點，其在腎臟活化可能成為新的治療靶點，以抵抗多種因素導致的腎臟疾病包括DN的發(fā)生發(fā)展〔3〕。本文結果表明白藜蘆醇具有明顯的腎臟保護作用。

細胞內SIRT1活性受代謝和環(huán)境因素的影響。熱量限制、饑餓、氧化應激和DNA損傷等都可誘導SIRT1表達增加，而高脂飲食、胰島素抵抗、高血糖、老化則引起SIRT1表達降低。SIRT1去乙?；孜锸羌毎x、能量消耗、炎癥和應激反應通路的中心調節(jié)因子〔6〕。如SIRT1可通過去乙?；嚢彼釟埢せ钸^氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(PGC)1α，增高線粒體生物能量合成〔7〕。葡萄糖是維持煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型/還原型(NAD+/NADH)穩(wěn)態(tài)的關鍵代謝底物，高血糖會通過影響重要代謝途徑降低胞質NAD+/NADH比率，從而影響SIRT1活性。綜上所述，高血糖狀態(tài)可影響SIRT1活性和線粒體功能，而SIRT1、線粒體功能均在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制中具有重要作用。

線粒體的動態(tài)變化包括線粒體分裂過程和線粒體融合過程。線粒體分裂、融合過程的平衡對于維持線粒體正常的形態(tài)、分布和功能十分重要〔8〕。本文表明線粒體的動態(tài)平衡在DN過程中發(fā)生變化。白藜蘆醇能明顯提高DN大鼠腎組織線粒體功能。白藜蘆醇可通過活化SIRT1從而影響線粒體動態(tài)平衡和功能發(fā)揮對DN大鼠腎臟功能的保護作用。

4 參考文獻

1侯振江，牟兆新，周秀艷，等. 尿微量白蛋白在糖尿病和高血壓腎病早期診斷中的應用〔J〕. 中國實驗診斷學,2010;14(9): 1389-92.

2Kume S,Thomas MC，Koya D.Nutrient sensing,autophagy,and diabetic nephropathy〔J〕. Diabetes,2012;61(1):23-9.

3Kitada M,Kume S,Takeda-Watanabe A,etal.Sirtuins and renal diseases: relationship with aging and diabetic nephropathy〔J〕.Clin Sci (Lond),2013;124(3):153-64.

4傅松波,湯旭磊,賈麗云,等.苦參堿對糖尿病大鼠腎臟的保護作用〔J〕.中國老年學雜志,2010;30(3):376-8.

5Jendrach M,Mai S,Pohl S,etal. Short and long-term alterations of mitochondrial morphology,dynamics and mtDNA after transient oxidative stress〔J〕. Mitochondrion,2008;8: 293-304.

6Moscat J,Diaz-Meco MT.Feedback on fat: p62-mTORC1-autophagy connections〔J〕. Cell,2011;147(4): 724-7.

7Nakahira K,Haspel JA,Rathinam VA,etal.Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome〔J〕. Nat Immunol,2011;12(3): 222-30.

8Lavu S,Boss O,Elliott PJ,etal.Sirtuins-novel therapeutic targets to treat age-associated diseases〔J〕. Nat Rev Drug Discov,2008;7(10): 841-3.