馬博清 李文叢 高琳輝 李 萍 霍麗梅

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050051)

腎小球系膜基質(zhì)積聚是糖尿病腎病(DN)發(fā)病早期重要的病理改變，能夠預(yù)測糖尿病腎病患者的臨床表現(xiàn)，其與腎小球濾過率的降低密切相關(guān)〔1〕；近年發(fā)現(xiàn)Smad1在糖尿病大鼠腎小球中的表達(dá)增加〔2〕，Smad1可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Ⅳ型膠原的產(chǎn)生〔3〕，從而促進腎小球系膜基質(zhì)的積聚。在DN中阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)可以延緩腎臟病變的進展，坎地沙坦作為較強的血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑，對于能否影響糖尿病大鼠腎小球Smad1的表達(dá)，減輕腎臟結(jié)構(gòu)及功能損傷，國內(nèi)尚無報道。本研究觀察坎地沙坦對糖尿病大鼠腎小球Smad1的表達(dá)和系膜基質(zhì)積聚的影響。

1 材料與方法

1.1動物模型制備和分組 清潔級雄性Wistar大鼠(200±20)g 36只，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。隨機選取24只大鼠，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)55 mg/kg，72 h后尾靜脈取血測隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。造模成功的大鼠隨機平分為糖尿病組和坎地沙坦組、正常對照組各12只?？驳厣程菇M大鼠給予5 mg·kg-1·d-1坎地沙坦灌胃，另兩組給予等量生理鹽水灌胃。實驗期間自由進食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.2標(biāo)本收集和指標(biāo)測定 干預(yù)12 w末測定全部大鼠尾動脈收縮壓(SBP)，然后置于代謝籠中收集24 h尿，記尿量，用于24 h尿白蛋白定量(24 h-UAE)、尿肌酐(Ucr)測定；全部大鼠稱重，用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，頸動脈取血，分離血清，測定空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)；切取左腎，去掉被膜稱重，然后分別置于4%多聚甲醛固定留作PAS染色及4%戊二醛中待電鏡觀察；迅速切取右腎，采用過篩網(wǎng)法微分離腎小球后置于-70℃液氮中凍存〔1〕，用于Western印跡檢測。肌酐清除率(Ccr)=：Ucr×每分鐘尿量(ml)/Scr，并以體重(kg)校正。腎重指數(shù)(KI)=左側(cè)腎臟重量(mg)/體重(g)。

1.3腎臟病理檢查 腎組織切片4 μm，行PAS染色；應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對PAS染色切片(400倍)進行圖像分析。每張切片隨機選取10個正切的腎小球，測定腎小球平均截面積(MGA)及腎小球內(nèi)PAS陽性染色面積，計算系膜基質(zhì)分?jǐn)?shù)(MMF)即PAS陽性染色面積/腎小球平均截面積，并根據(jù)MGV= β/K×(MGA)3/2計算腎小球平均體積(MGV)〔2〕。使用透射電鏡觀察腎小球基底膜的厚度、系膜基質(zhì)及足突變化情況。

1.4Western 印跡檢測腎小球Smad1的表達(dá) 應(yīng)用RIPA裂解液，提取腎小球總蛋白，蛋白含量測定采用BCA法。取蛋白樣品50 μg，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(小鼠抗大鼠Smad1抗體1∶200)4℃過夜。洗膜后包被二抗，DAB顯色，以β-actin作為內(nèi)參照。用凝膠成像儀照相，Quantity One軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1大鼠各項指標(biāo)變化及比較 干預(yù)12 w后，與正常對照組相比，糖尿病組FBG、24 h-UAE、KI、Ccr均顯著升高(P<0.01)；與糖尿病組相比，坎地沙坦組除FBG外，均明顯降低(P<0.05)；3組間大鼠SBP無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)。見表1。

2.2腎小球形態(tài)病理變化 PAS染色顯示正常對照組大鼠腎小球無明顯病理改變；糖尿病組大鼠腎小球內(nèi)PAS陽性染色物質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞增生，腎小球基底膜增厚；坎地沙坦組上述腎小球病理改變程度均有減輕(圖1)。與正常對照組比較，糖尿病組大鼠MGA和MGV均顯著增大(P<0.01)，MMF明顯增高(P<0.01)；坎地沙坦組較糖尿病組MGA、MGV及MMF均明顯減小(P<0.05)(表2)。透射電鏡顯示：正常對照組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜均勻一致，足突排列整齊；糖尿病組腎小球毛細(xì)血管基底膜不均勻增厚，系膜基質(zhì)增多，足突增粗、融合破壞；經(jīng)坎地沙坦干預(yù)12 w后，大鼠腎小球基底膜增厚程度、系膜基質(zhì)增多程度均有所減輕，僅有少量足突融合、破壞(圖2)。

2.3腎小球Smad1蛋白的表達(dá) 正常對照組大鼠腎小球有少量Smad1的表達(dá)，糖尿病組大鼠腎小球Smad1的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；坎地沙坦組較糖尿病組大鼠腎小球Smad1表達(dá)減弱(P<0.05)(表2)。

2.4相關(guān)分析 大鼠腎小球Smad1的表達(dá)與MMF(r=0.891，P<0.01)呈明顯正相關(guān)；24 h-UAE與MMF(r=0.345，P>0.05)無明顯相關(guān)性。

圖1 各組大鼠腎小球形態(tài)學(xué)變化(PAS，×400)

圖2 各組大鼠腎小球形態(tài)學(xué)變化(PAS)

表1 各組大鼠FBG、24 h-UAE、KI、Ccr及SBP的比較±s)

表2 各組大鼠MGA、MGV、MMF及腎小球Smad1表達(dá)的比較±s)

3 討 論

腎小球系膜基質(zhì)積聚是早期DN重要的病理改變，能夠預(yù)測DN患者的臨床表現(xiàn)，其與腎小球濾過率的降低密切相關(guān)。

本研究提示Smad1與糖尿病腎小球系膜基質(zhì)的積聚有關(guān)。與Matsubara等〔3〕的研究結(jié)果一致。

本研究還顯示糖尿病大鼠在使用坎地沙坦干預(yù)之后，腎小球Smad1的表達(dá)明顯減少，病理改變的程度減輕，推斷血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可能是誘導(dǎo)腎小球Smad1產(chǎn)生的因素之一。國外已有研究〔4〕發(fā)現(xiàn)，AngⅡ是經(jīng)由Src活化了Smad1的表達(dá)，因為在使用了Src酪氨酸激酶抑制劑后Smad1的活化也同時受到了抑制。

目前微量白蛋白尿被認(rèn)為是糖尿病腎臟早期損傷的重要標(biāo)志，然而微量白蛋白尿的預(yù)測價值并不如原來所想的那樣精確。研究表明，有或沒有微量白蛋白尿的糖尿病病人在血壓正常、肌酐清除率未降低時，他們的腎小球結(jié)構(gòu)的改變沒有明顯的不同〔5，6〕。本研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠24 h-UAE排泄量與腎小球系膜基質(zhì)的積聚無明顯的相關(guān)性，即不能準(zhǔn)確地反映腎小球結(jié)構(gòu)損傷的程度，而腎小球Smad1的表達(dá)與這種病理改變密切相關(guān)。Mima等〔7〕最新研究發(fā)現(xiàn)， STZ大鼠發(fā)病早期尿中Smad1排泄的增加與晚期腎小球硬化的發(fā)展密切相關(guān)。他們還對db/db小鼠做了這方面的研究，也得到了相似的結(jié)果，認(rèn)為尿中Smad1的排泄水平可以成為預(yù)測后期腎臟病變進展的新的標(biāo)志物。

給伴有腎臟疾病的2型糖尿病患者使用AngⅡ受體阻滯劑可以獲得比安慰劑和其他抗高血壓藥物更好的腎臟保護作用，說明了這類藥物的腎臟保護作用不只歸因于對血壓的控制。本實驗也得到了一致的結(jié)果，說明腎小球的高濾過狀態(tài)得到改善。本研究還提示坎地沙坦的抗腎小球硬化作用可能部分是通過抑制腎小球Smad1的產(chǎn)生及活化來實現(xiàn)的。

4 參考文獻

1Regoli M，Bendayan M.Alterations in the expression of the alpha3 betal integrin in certain membrane domains of the glomerular epithelial cells(podocytes) in diabetes mellitus〔J〕.Diabetologia，1997；40:15-22.

2Ota T，Takamura T，Ando H,etal.Preventive effect of cerivastatin on diabetic nephropathy through suppression of glomerular macrophage recruitment in a rat model〔J〕.Diabetologia，2003；46:843-51.

3Matsubara T，Abe H，Mima A,etal.Expression of Smad1 is directly associated with glomerulosclerosis in diabetic nephropathy〔J〕.Lab Invest，2006；86:357-68.

4Mima A，Matsubara T，Abe H,etal.Angiotensin Ⅱ-dependent Src and Smad1 signaling pathway is crucial for the development of diabetic nephropathy〔J〕.Lab Invest，2006；86:927-39.

5Chavers BM,Bilous RW,Ellis EN,etal.Glomerular lesions and urinary albumin excretion in type I diabetes without overt proteinuria〔J〕.N Engl J Med，1989；320:966-70.

6Fioretto P，Steffes MW，Mauer M.Glomerular structure in nonproteinuric IDDM patients with various levels of albuminuria〔J〕.Diabetes，1994；43:1358-64.

7Mima A，Arai H，Abe H,etal.Urinary Smad1 is a novel marker to predict later onset of mesangial matrix expansion in diabetic nephropathy〔J〕. Diabetes，2008；57:1712-22.