姚 佳 彭 梅 胡江義 肖 雄 唐健波 楊 娟

(貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002)

阿霉素(ADM)屬蒽環(huán)類抗生素，具有抗瘤譜廣、作用強的特點，是目前最常用的抗腫瘤藥物之一，其不良反應較多，最嚴重的是劑量依賴性心臟毒性，主要表現(xiàn)為心肌收縮力影響，嚴重時為充血性心力衰竭，正是由于ADM的心臟毒性限制了其臨床應用〔1，2〕。因此探討ADM所致心臟毒性的機制，尋找有效的防護藥物具有重要意義。與單純使用化療藥物相比，與生物反應調(diào)節(jié)劑合用能更有效地提高機體的免疫力，減少化療藥物劑量，增強抑瘤效果，保證化療順利完成。多糖由于它的高效、低毒，被認為是理想的生物反應調(diào)節(jié)劑。仙茅多糖(COP)是從仙茅根莖中經(jīng)水提醇沉后得到，具有調(diào)劑免疫、抗氧化作用〔3，4〕。本文通過動物模型，探討COP對小鼠心肌損傷的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級KM小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2007-001。

1.2藥品與試劑 COP由本課題組提供，多糖含量≥50%；阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號1103E3)；維生素E軟膠囊(湖南中和制藥有限公司，批號120301)；血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉氨酶(GOT)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20120904、20120903、20120 905、20120904、20120905、20120904)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器 FA114精密電子天平(上海?？惦娮觾x器廠)；MD Spectra Max-190連續(xù)波長酶標儀(美國MD公司)；OLMYPUS顯微鏡CX31(日本奧林巴斯)；Eppendorf 5418R離心機(德國Eppendorf公司)。

1.4方法

1.4.1動物分組及給藥 KM小鼠70只，自由進食和飲水，適應性飼養(yǎng)3 d，隨機分為空白組：灌胃(ig)生理鹽水，0.2 ml/10 g，1次/d，連續(xù)15 d；ADM組：腹腔注射(ip)注射ADM 3 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥5 d；COP組：每日ig COP 400 mg/kg，連續(xù)給藥15 d；ADM+COP低、中、高劑量組：建模同ADM組，同時每日分別ig COP 300、400、500 mg/kg；VitE組：建模同ADM組，同時每日ig VitE 2 mg/kg，連續(xù)15 d。每組10只，雌雄各半。

1.4.2血清生化指標檢測 末次給藥后小鼠眼眶取血，4 000 r/min離心15 min，取血清置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，按試劑盒說明測定血清CK、LDH、GOT、NOS、SOD和MDA。

1.4.3心肌生化指標檢測 按上述方法取完血后迅速取出小鼠心臟，剪下一半迅速稱重，放入-20℃條件冰凍，將速凍的心臟組織取出，冰浴條件下用勻漿器反復研磨，用生理鹽水(使用前放至4℃冰箱預冷)按1∶9比例制成10% 的勻漿3 500 r/min離心10 min，取上清液置4℃冰箱備用，按試劑盒說明測定SOD活性和MDA含量。

1.4.4病理學檢查 取上述未勻漿的部分心臟組織，10%多聚甲醛固定，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下檢查。

1.5統(tǒng)計學方法 組間比較行t檢驗。

2 結 果

2.1COP對小鼠血清GOT、CK、LDH、NOS活力的影響 與空白組比較，ADM組GOT、CK、LDH、NOS活力均顯著增加(P< 0.01)；與ADM組比較，ADM和COP低、中、高劑量合用組以及陽性對照VE組以上各指標均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2COP對小鼠血清和心臟SOD和MDA的影響 與空白組比較，ADM組血清和心臟MDA含量增加，SOD活力降低(P<0.01)；而與ADM組比較，VE、ADM和COP合用各組MDA含量明顯降低，SOD活力增加(P<0.05或P<0.01)。

2.3病理學檢查 光學顯微鏡下觀察正常小鼠心肌細胞完整，排列整齊，細胞間隙均勻，肌纖維之間紅細胞極少，未見水腫，細胞核清晰；ADM組心肌細胞呈不同程度的空泡變性，肌纖維斷裂，肌纖維間隙紅細胞堆積，細胞核模糊。ADM聯(lián)合COP各組心肌細胞輕度腫脹，幾乎無心肌細胞空泡樣變，肌纖維完整。見圖1。

表1 COP對小鼠血清GOT、CK、LDH、NOS活力的影響±s，n=10)

表2 COP對小鼠血清和心臟 SOD和MDA的影響±s，n=10)

圖1 各組小鼠心肌細胞形態(tài)(HE，×400)

3 討 論

ADM被用作一種高效、廣譜的抗腫瘤藥物已有近40年的歷史，對乳腺癌、食道癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、Kaposi肉瘤和軟組織肉瘤均有較好的療效〔5〕。但是ADM與心肌細胞的高親和力使其在治療腫瘤的同時，存在劑量依賴性心臟毒性。ADM進入心肌后，被微粒體還原型輔酶Ⅱ(NADHP)及細胞色素P450還原酶催化為半醌代謝物，直接損傷細胞核和細胞成分，引起細胞損傷〔6〕。本實驗結果提示3 mg/kg ADM 就能誘發(fā)小鼠明顯的心肌損傷。

正常情況下，細胞中存在著完整的抗氧自由基(OFR)酶系統(tǒng)，如SOD、過氧化氫酶(CAT)及過氧化物酶(POD)，它們通過各自的反應清除OFR，使細胞免受損傷。ADM使心肌細胞內(nèi)負責清除OFR的內(nèi)源性抗氧化劑活性降低，不能有效地保護心肌細胞免受OFR的損傷〔7～9〕。大量研究〔10～13〕表明，ADM所致心臟毒性與氧化應激有關，表現(xiàn)在ADM誘發(fā)心肌損傷的同時可引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(如MDA)含量增多，抗氧化酶(如SOD)活性下降。組織中MDA含量可反映脂質(zhì)過氧化的程度，并間接反映該組織損傷情況。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化應激酶，MDA、SOD被研究學者視為藥物干預ADM心臟毒性藥效學研究的重要指標。研究顯示提高抗氧化酶的活性可對不同形式的氧化性損傷具有保護作用。

同時大量研究〔14～16〕表明，NO在調(diào)節(jié)氧化應激與組織損傷過程中起重要作用，是由NOS催化L-精氨酸和分子氧反應而生成的氧化產(chǎn)物。機體內(nèi)NOS有cNOS和iNOS兩種，一般可根據(jù)基因表達和所需輔助因子來區(qū)分。正常生理情況下，iNOS的基因不表達，只有在內(nèi)毒素和某些細胞因子的刺激下才得以和表達，并在輔助因子和NADPH的作用下生成大量的NO。據(jù)報道，NO與超氧化物陰離子(O2-)反應生成超氧亞硝基陰離子(ONOO-)，后者可分解羥自由基(OH)而產(chǎn)生毒性，造成細胞或組織的損傷〔17〕。本研究結果表明，在注射 ADM后NOS含量明顯高于空白對照組，推測NOS的產(chǎn)生可能是由于氧化應激反應中自由基引起的。NOS產(chǎn)生增加，引起NO釋放，導致心肌病理損傷，NOS含量變化與血清GOT、CK、LDH變化完全一致。

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