梁倩影 劉先領(lǐng)

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410000)

盡管外科手術(shù)水平和肝癌移植技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但由于肝癌起病隱匿，侵襲生長迅速，80%以上的肝癌患者在確診時(shí)已存在肝癌播散、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、門脈癌栓或伴有嚴(yán)重的肝硬化，不能進(jìn)行手術(shù)。包括全身化療在內(nèi)的非手術(shù)療法仍不失為延長生存、提高生活質(zhì)量的重要方法〔1〕。隨著替吉奧、卡培他濱等新型化學(xué)治療藥物的問世，口服單藥化療逐漸成為臨床上采用的姑息性治療方法〔2〕。腫瘤生物免疫治療作為一種新興的治療手段成為近年來腫瘤治療領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題。樹突細(xì)胞(DC)是目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)是一種在體外經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)、增殖而得的具有抗瘤譜廣、殺瘤活性高的特性的免疫活性細(xì)胞。本研究采用DC-CIK自體免疫細(xì)胞聯(lián)合替吉奧治療中晚期肝癌患者，分析療效。

1 資料與方法

1.1入選標(biāo)準(zhǔn) (1)經(jīng)影像學(xué)或病理活檢確診的中晚期肝癌患者，無法行手術(shù)治療，不適合或不考慮行肝動(dòng)脈栓塞化療者；(2)患者自愿接受上述治療并簽署同意書 ；(3)肝功能Child-Pugh分級(jí)為A或B患者；(4) 各項(xiàng)常規(guī)、生化檢查指標(biāo)無相關(guān)禁忌證；(5)Kamofsky評(píng)分≥60，無嚴(yán)重的心、肺、腎功能障礙及全身惡液質(zhì)情況；(6)預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；(7)無明顯感染，無精神類疾病。

1.2研究對(duì)象 我科2011年1月至2013年5月經(jīng)檢查確診為中晚期肝癌的患者48例，男34例，女14例，年齡31～72(平均48.6)歲，經(jīng)影像學(xué)或病理活檢確診但無法行手術(shù)治療，不適合或不同意行肝動(dòng)脈栓塞化療者。巨塊型肝癌26例，多發(fā)結(jié)節(jié)型肝癌22例，其中外科手術(shù)失敗或術(shù)后復(fù)發(fā)患者9例?；颊吒蝺?nèi)病灶2 cm×3 cm～13.0 cm×15.1 cm，含肝硬化、門靜脈及下腔靜脈癌栓、腹腔積液、黃疸、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。28例有原發(fā)病或(和)轉(zhuǎn)移瘤的病理學(xué)或組織細(xì)胞學(xué)證據(jù)，所有病例均有相應(yīng)的影像學(xué)資料，有可見原發(fā)灶或(和)轉(zhuǎn)移病灶可供評(píng)估療效。

1.3治療方法 所有入組病例均先行外周血單核細(xì)胞采集，標(biāo)本送實(shí)驗(yàn)室行DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增，后開始口服替吉奧治療，細(xì)胞培養(yǎng)完成后安排自體DC-CIK細(xì)胞輸注治療。12 w為1個(gè)療程，如無明顯不良反應(yīng)則重復(fù)療程。治療期間每周查血常規(guī)1次，每2 w查肝功能1次，白細(xì)胞計(jì)數(shù)<3×109/L或肝功能異常時(shí)停藥2 w后進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)藥物反應(yīng)性好及可耐受治療者停藥2～4 w后可繼續(xù)治療。

1.3.1替吉奧(S-1)治療 根據(jù)體表面積來確定初始劑量，體表面積<1.25 m2，S-1 40 mg/次，2次/d；體表面積1.25～1.5 m2，S-1 50 mg/次，2次/d；體表面積>1.5 m2，S-1 60 mg/次，2次/d，早飯后和晚飯后分別口服1次，連續(xù)服用28 d(4 w)，停藥14 d(2 w)。12 w為1個(gè)療程。

1.3.2DC-CIK治療 (1)細(xì)胞分離：經(jīng)CS-3000血細(xì)胞分離機(jī)采集患者外周血5L中的新鮮抗凝外周血單核細(xì)胞，再用聚蔗糖400(Ficoll 400)分離后經(jīng)Hank液洗3次，收集純度在90%以上的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)。

(2)CIK體外培養(yǎng)和擴(kuò)增：將PBMNC加入到含1 000 U/ml 干擾素(IFN)-γ和自體血清的完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.0×106個(gè)/ml，24 h后加入白細(xì)胞介素(IL-2) 1 000 U/ml和CD3單抗0.5 μg/ml，后根據(jù)CIK生長情況每隔2～3 d適時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基和IL-2，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d后。2次/w測(cè)定白細(xì)胞增殖率和CD3、CD56陽性細(xì)胞率，當(dāng)細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增達(dá)到設(shè)計(jì)目標(biāo)，陽性目標(biāo)細(xì)胞達(dá)到85%時(shí)，離心收集細(xì)胞，同時(shí)取樣做質(zhì)量檢控(參照柯萊遜《質(zhì)量檢控標(biāo)準(zhǔn)》CLS-T-W-009)。將合格的CIK分4次靜脈回輸至患者體內(nèi)，單次回輸CIK數(shù)目不少于1.0×109個(gè)。

(3)DC體外培養(yǎng)和擴(kuò)增：將CS-3000分離得到的PBMNC用無血清1640培養(yǎng)液重懸，濃度為2×106/ml鋪入6孔板，孵育2 h后棄上清，獲得貼壁單核細(xì)胞，加入DC完全培養(yǎng)基(含GM-CSF 100 ng/ml和IL-4 500 U/ml)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中；培養(yǎng)第5天加入腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)DC成熟，第7～8天收集懸浮的DC，同時(shí)取樣做質(zhì)量檢控(參照柯萊遜《質(zhì)量檢控標(biāo)準(zhǔn)》CLS-T-W-009)。將合格的DC分4次靜脈回輸至患者體內(nèi)，單次回輸DC數(shù)目不少于1.0×107個(gè)。

(4)細(xì)胞回輸方案：患者一般狀況良好，細(xì)胞培養(yǎng)成熟后開始交替回輸CIK和DC，2～3次/w，一次回輸CIK不少于1×109個(gè)，DC不少于1×107個(gè)。

(5)外周血免疫功能檢測(cè)：細(xì)胞治療前及治療完成4 w后檢測(cè)患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+)變化。

1.4觀察及療效評(píng)估 觀察指標(biāo)包括治療前后瘤體變化、外周血免疫指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物、癥狀改變、生活質(zhì)量及不良反應(yīng)等。療效評(píng)估采用美國癌癥研究所制定的實(shí)體腫瘤RESIST療效評(píng)估方法,將療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD)，總有效率(RR)=CR+PR，疾病控制率(DCR)=CR+PR+SD〔5〕。記錄患者治療前后食欲、睡眠、精神、體力等情況，用 Karnofsky 計(jì)分法(KPS)判斷治療前及治療后生活質(zhì)量的改善情況，凡在治療后較治療開始前計(jì)分提高10分以上者為改善，下降10分以上者為惡化，提高或下降10分者為穩(wěn)定，總提高率=(改善+穩(wěn)定)×100%。不良反應(yīng)按WHO抗腫瘤藥物不良反應(yīng)的分度標(biāo)準(zhǔn)，分為0～Ⅳ度〔5〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1瘤體變化 48例中晚期肝癌病例均有可測(cè)量病灶，經(jīng)DC-CIK聯(lián)合替吉奧治療1個(gè)周期(12 w)后，采用彩超、CT、MRI等影像學(xué)檢查方法測(cè)量病灶大小，按RESIST實(shí)體瘤的近期療效標(biāo)準(zhǔn)，其中CR 0例，PR 10例，SD 22例，PD 16例，總有效率(RR)為20.8%，疾病控制率(DCR)為66.7%。

2.2外周血免疫指標(biāo)變化 治療后外周血CD3+、CD4+百分率，CD4+/CD8+比值明顯上升(P<0.05)；NK細(xì)胞(CD16+CD56+)比例較前上升，T毒性/抑制細(xì)胞(CD3+CD8+)較前下降，但差異不明顯(P>0.05)。見表1。

表1 治療前后免疫指標(biāo)變化±s，n=48)

2.3臨床癥狀緩解情況 48例中晚期肝癌患者經(jīng)1個(gè)療程(12 w)治療后在乏力(32 vs 40例)、食欲不振(25 vs 32例)、疼痛(12例 vs 22例)腹水(16例 vs 28例)、黃疸(23 vs 34例)、腹脹(19例 vs 26例)等方面得到明顯緩解。

2.4KPS評(píng)分變化情況 積極治療后，大部分患者的KPS評(píng)分得到提高，平均提高10～20分，總提高率高達(dá)89.6%。 見表2。

表2 治療前后患者KPS評(píng)分情況(n)

2.5毒副反應(yīng) 主要的不良反應(yīng)是中性粒細(xì)胞減少、消化道反應(yīng)及皮膚色素沉著，其中Ⅰ度粒細(xì)胞減少者6例，Ⅱ度減少2例，無Ⅲ、Ⅳ度減少者，經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)治療后粒細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)正常，不影響繼續(xù)用藥。6例患者出現(xiàn)惡心癥狀，2例患者出現(xiàn)短暫嘔吐，48例患者均未出現(xiàn)Ⅲ度及以上消化道反應(yīng)。3例患者治療后出現(xiàn)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)輕度升高，加強(qiáng)護(hù)肝治療后ALT恢復(fù)正常并完成治療。4例患者回輸DC-CIK細(xì)胞后出現(xiàn)發(fā)熱，體溫均低于38.6℃，持續(xù)時(shí)間2～6 h，有1例給予酚咖片處理外，其他3分自行緩解。

3 討 論

替吉奧是一種氟尿嘧啶衍生物口服抗癌劑，是替加氟(FT)、吉美嘧啶(CDHP)和奧替拉西鉀(Oxo)三種藥物組成的復(fù)方制劑，與5-FU相比具有以下優(yōu)勢(shì)：①能維持較高的血藥濃度并提高抗癌活性；②明顯減少藥毒性；③給藥方便。替吉奧在胃癌上已顯示較好的療效,甚至可以與聯(lián)合方案相媲美，在原發(fā)性肝癌的小樣本研究中也顯示出可喜的效果,且與5-FU不完全交叉耐藥〔3〕。

乙型肝炎病毒慢性感染是我國肝癌的主要致病原因，患者體內(nèi)存在不同程度的免疫功能缺陷。研究顯示〔4〕，肝癌患者存在外周血 DC 成熟障礙，主要表現(xiàn)為循環(huán) DC 低表達(dá)組織相溶性復(fù)合體(MHC-Ⅱ)和 白細(xì)胞介素(IL- 12)；攝取抗原顆粒以及同種 T 細(xì)胞刺激能力下降。本文應(yīng)用的 DC 是經(jīng)過體外活化和擴(kuò)增，并經(jīng)過肝癌組織特異性抗原(AFP)刺激的成熟 DC，國外實(shí)驗(yàn)證明, 用 AFP 致敏的DC可抑制肝細(xì)胞癌的生長, 且對(duì)正常肝細(xì)胞的再生沒有影響〔5〕。本文應(yīng)用的 CIK 細(xì)胞是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子(如抗 CD3McAb、IL-2、IFN-γ等) 共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群高數(shù)量細(xì)胞群，單個(gè)療程可達(dá) 1×109個(gè)，CIK兼具有淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性和自然殺傷(NK)細(xì)胞的非主要MHC-Ⅱ限制性殺瘤特點(diǎn)，它是迄今發(fā)現(xiàn)的所有免疫效應(yīng)細(xì)胞中增殖能力最強(qiáng)、細(xì)胞毒活性較強(qiáng)的細(xì)胞。DC和CIK細(xì)胞是腫瘤免疫治療的兩個(gè)重要部分，二者聯(lián)合可以有效提高機(jī)體的免疫功能，改善生存質(zhì)量，延長生存期，同時(shí)增加化療敏感性，降低化療不良反應(yīng)。以往認(rèn)為化療主要對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制的負(fù)面影響。然而，近幾年來借助新的研究技術(shù)和較理想的動(dòng)物模型，對(duì)化療和免疫反應(yīng)的相互作用有了更深入的了解，認(rèn)為化療對(duì)腫瘤的免疫功能存在雙重的影響。替吉奧為氟尿嘧啶類的氟化物，通過在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-FU，可作為一種免疫調(diào)節(jié)劑。5-FU通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的抗原及MHC分子的表達(dá)，從而恢復(fù)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷活性。通過選擇性清除髓系來源抑制細(xì)胞(MDSCs)，提高后續(xù)免疫治療的療效〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)，DC-CIK能夠增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，改善機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔7〕。

綜上所述，自體免疫細(xì)胞DC-CIK聯(lián)合替吉奧治療中晚期肝癌，具有較好的抗腫瘤作用及輕微的毒副反應(yīng)，改善患者生活質(zhì)量，安全性高，是中晚期肝癌治療的新選擇。

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