張國強(qiáng) 李 玲 程 毅 高順強(qiáng)

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050011)

毛乳頭細(xì)胞是位于毛囊基底部的一群真皮源性細(xì)胞，其顯著的生物學(xué)特性為體內(nèi)外表現(xiàn)為凝集性的生長方式及體內(nèi)外具有誘導(dǎo)毛囊形成的能力。研究表明毛乳頭細(xì)胞分泌的多種生長因子如胰島素樣生長因子1(IGF-1)，成纖維細(xì)胞生長因子7 (FGF7)及干細(xì)胞因子(SCF)等均可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的人毛乳頭細(xì)胞的增殖〔1，2〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)即血管滲透因子或血管調(diào)理素。它是毛乳頭自分泌的一種生長因子并可作用于毛乳頭細(xì)胞。VEGF的生物學(xué)功能一是增加血管的通透性，二是刺激血管生成〔3，4〕。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察不同代次毛乳頭細(xì)胞表達(dá)VEGF的情況，并通過人工干預(yù)的方法加入VEGF觀察其對毛乳頭細(xì)胞生長曲線的影響。

1 材料和方法

1.1設(shè)計(jì) 細(xì)胞對比觀察實(shí)驗(yàn)。時間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2009年5月至2010年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心及河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻喉科實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2材料 頭皮取自2009～2010年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)患者，年齡20～40歲，無系統(tǒng)性疾病，均取得患者同意，離體6 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3試劑 分離酶、膠原酶D、L-谷氨酰胺、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜購于美國Sigma公司，鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體購于美國Neomarker公司，胎牛血清購于杭州四季青生物材料有限公司，重組人VEGF、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，VEGF單克隆抗體購于北京中杉金橋生物有限公司。

1.4毛乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng) 人毛乳頭細(xì)胞采用兩步酶消化分離法分離〔5〕，得到純化的人毛乳頭細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻后，以每培養(yǎng)瓶30～50個毛乳頭的密度接種。待毛乳頭貼壁后換液，去除未貼壁的單個細(xì)胞及雜質(zhì)。分離出的毛乳頭3 d后90%貼壁，貼壁1 d后可觀察到細(xì)胞遷出呈放射狀生長，通過α-平滑肌肌動蛋白染色、甲苯胺藍(lán)染色、PAS染色鑒定為毛乳頭細(xì)胞。2～3 w后細(xì)胞大部分生長融合。6代之前細(xì)胞可見凝集性生長，隨細(xì)胞傳代次數(shù)增加該特性逐漸消失。免疫組織化學(xué)染色檢測血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)：分別取凝集性生長的第3代、第6代和非凝集性生長的第9代毛乳頭細(xì)胞，0.25%胰酶消化后接種至放有蓋玻片的6孔板中，體積分?jǐn)?shù)5%CO2溫箱37℃孵育24 h，收取蓋玻片，40 g/L多聚甲醛固定15 min，4 ℃過夜。以鼠抗人VEGF單克隆抗體作一抗對3個代次的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行染色，按SP法介紹的步驟進(jìn)行〔6〕。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.5流式細(xì)胞儀檢測VEGF表達(dá) 取第3，6，9代毛乳頭細(xì)胞，洗滌后調(diào)整毛乳頭細(xì)胞濃度為1×109/L，分別加入兔抗人VEGF單克隆抗體工作液，室溫避光反應(yīng)2 h，PBS液洗滌后，加入二抗工作液100 μl，孵育30 min，PBS洗滌，上流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果分析：生長因子表達(dá)量用均道值表示。

1.6MTT法檢測血管內(nèi)皮生長因子對毛乳頭細(xì)胞生長的影響 取對數(shù)生長期的第3代人毛乳頭細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/L，按每孔200 μl加入96孔板中，將實(shí)驗(yàn)分為20 μg/L的VEGF組及只加培養(yǎng)基的空白對照組。每組設(shè)7個時相點(diǎn)，每個時相點(diǎn)設(shè)3個復(fù)孔。隔日檢測1次。于各時相點(diǎn)時前4 h，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清液，棄之，過每管加入二甲基亞砜150 μg，避光條件下振蕩10～15 min，用全自動酶標(biāo)儀于波長492 nm處測定各孔吸光度值，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

1.7主要觀察指標(biāo) 免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞儀測定第3，6，9代人毛乳頭細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。MTT法測定VEGF對人毛乳頭細(xì)胞的增殖作用。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1毛乳頭細(xì)胞中VEGF的表達(dá) VEGF表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)，著色由黃色到褐色不等。胞質(zhì)出現(xiàn)黃色顆粒為(+)，棕色顆粒為()，褐色顆粒為()。第3，6，9代毛乳頭細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色后VEGF表達(dá)分別為、和+。VEGF隨著毛乳頭細(xì)胞代次的增多，表達(dá)逐漸減弱，空白對照為陰性。見圖1。

2.2流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 第3，6，9代毛乳頭細(xì)胞VEGF的均道值分別為312.94±7.98，269.62±31.42，180.16±15.40，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩相比差異顯著(F=21.42,P=0.002)。

第3代

第6代

第9代

2.3MTT法檢測VEGF對毛乳頭細(xì)胞生長的影響 根據(jù)MTT測得的A值，可見兩組細(xì)胞的停滯期不盡相同，3代細(xì)胞的VEGF組為2 d，而空白對照組為4 d，隨后進(jìn)入對數(shù)生長期。并且VEGF組在10 d后與已經(jīng)進(jìn)入緩慢生長期的空白對照組相比仍然保持著良好的生長狀態(tài)。通過比較各組細(xì)胞的吸光度(A)值發(fā)現(xiàn)3代細(xì)胞體外培養(yǎng)4 d后VEGF組較空白對照組明顯升高。隨著培養(yǎng)時間的延長，VEGF組的A值與空白對照組相比明顯升高，A值在一定范圍內(nèi)可以反映細(xì)胞數(shù)，故VEGF可以促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的增殖。見表1。

表1 血管內(nèi)皮生長因子對毛乳頭細(xì)胞的吸光度值的影響±s)

3 討 論

VEGF和毛囊生物學(xué)有著密切的關(guān)系，很多學(xué)者在這方面進(jìn)行了研究。Lachgar等〔7〕通過免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的大鼠觸須毛囊的毛乳頭細(xì)胞在生長期抗VEGF染色陽性，體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞胞質(zhì)中抗VEGF染色亦陽性。進(jìn)一步研究證明了VEGF能特異性地結(jié)合培養(yǎng)的鼠觸須毛乳頭細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖和遷移，其促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖的最大效應(yīng)為堿性成纖維細(xì)胞生長因子的一半，而對遷移的影響為堿性成纖維細(xì)胞生長因子的3倍，應(yīng)用抗VEGF的中和性抗體可以阻斷重組VEGF和毛乳頭起源的VEGF的活性，從而首次證實(shí)VEGF是毛乳頭細(xì)胞的一種自分泌生長因子。Kozlowska等〔8〕采用RT-PCR和Northern印跡法證明培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞可以分泌VEGF121、VEGF145、VEGF165和VEGF189，4種形式的VEGF mRNA，其中以VEGF121含量最高，而VEGF189含量最低，進(jìn)一步利用放射免疫沉淀法證明毛乳頭細(xì)胞提取物和培養(yǎng)的上清中有VEGF蛋白的表達(dá)，還通過免疫組織化學(xué)證明毛乳頭細(xì)胞胞漿抗VEGF染色亦陽性。臨床上促進(jìn)毛發(fā)生長的藥物如：米諾地爾，拉坦前列素及各種中藥都促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞合成和分泌VEGF，并且分泌VEGF的量和藥物濃度有劑量依賴關(guān)系〔9～11〕。反之斑禿患者的毛乳頭細(xì)胞VEGF表達(dá)減弱或消失。而雄激素性脫發(fā)患者脫發(fā)區(qū)與非脫發(fā)區(qū)毛乳頭的體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，脫發(fā)區(qū)毛乳頭體積較小，毛乳頭細(xì)胞生長緩慢，毛乳頭細(xì)胞分泌VEGF的量減少，而細(xì)胞形態(tài)和凝集性生長無明顯變化〔11〕?？梢娒轭^細(xì)胞分泌VEGF障礙與毛發(fā)疾病有相關(guān)性。

郭曉靜等〔12〕也證明體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞能夠合成與分泌VEGF，VEGF表達(dá)胞質(zhì)內(nèi)，并隨著體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，VEGF的表達(dá)逐漸減弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞傳代次數(shù)的增加VEGF表達(dá)減弱，VEGF可以縮短毛乳頭細(xì)胞生長曲線的停滯期，提早進(jìn)入對數(shù)生長期，并且延遲進(jìn)入平臺期的時間。VEGF是毛乳頭細(xì)胞的自分泌因子，當(dāng)毛乳頭細(xì)胞的合成分泌功能降低時，其生長增殖功能以降低。VEGF對細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用，但其具體作用機(jī)制還有待繼續(xù)研究。

4 參考文獻(xiàn)

1張國強(qiáng)， 李 玲， 程 毅，等.干細(xì)胞因子對體外培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞生長特性的影響〔J〕.中國皮膚性病學(xué)雜志，2010；24(11): 1000-2.

2張國強(qiáng)，程 毅，李 玲，等.胰島素樣生長因子-1和成纖維細(xì)胞生長因子7與毛乳頭細(xì)胞的生長〔J〕.中國組織工程與臨床康復(fù)雜志，2010；14(50): 9346-8.

3Kajdaniuk D,Marek B,Foltyn W,etal.Vascular endothelial growth factor (VEGF) -part 1: in physiology and pathophysiology〔J〕.Endokrynol Pol,2011；62(5): 444-55.

4羅美蓉，王正偉，安志星.人血管內(nèi)皮生長因子研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(17): 3835-7.

5程 波，劉榮卿，伍津津，等.改良毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)法〔J〕.中華皮膚科雜志，2001；34(5): 387-8.

6Randall VA,Hibbrts NA,Hamada K,etal.A comparison of the cultured and growth of dermal papilla cells derived from normal and balding〔J〕.Br J Dermatol,1996;134(3): 437-44.

7Lachgar S,Moukadiri H,Jonca F,etal.Vascular endothelial growth factor is an autocrine growth factor for hair dermal papilla cells〔J〕.J Invest Dermatol,1996;106(1):17-23.

8Kozlowska U,Blume-Peytavi U,Kodelja V,etal.Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in various compartments of the human hair follicle〔J〕.Arch Dermatol Res,1998;290(12): 661-8.

9Han JH,Kwon OS,Chung JH,etal.Effect of minoxidil on proliferation and apoptosis in dermal papilla cells of human hair follicle〔J〕.J Dermatol Sci,2004;34(2): 91- 8.

10關(guān)寧寧，陳蕾，孫蔚凌，等.精氨酸對人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響〔J〕.臨床皮膚科雜志，2011；40(6)：335-9.

11陳 蕾，關(guān)寧寧，孫蔚凌，等.咖啡因?qū)w外培養(yǎng)人毛囊及毛乳頭細(xì)胞的影響〔J〕.臨床皮膚科雜志，2011；40(6)：323-7.

12郭曉靜，郝 飛，姜曉勇，等.人毛乳頭細(xì)胞在不同傳代時期某些細(xì)胞因子表達(dá)的變化〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006；28(21)：2144-5.