陳俊任 楊定華 孫艷華 韓 慶 張敏杰

(南方醫(yī)科大學(xué)深圳市第二人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510515)

肝細(xì)胞癌(HCC)術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因〔1〕，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是HCC術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的主要機(jī)制之一〔2〕。EMT發(fā)生主要表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物如E-cadherin和ZO-1表達(dá)減少，而間質(zhì)標(biāo)志物如Vimentin和N-cadherin表達(dá)增加〔3〕，研究證實(shí)E-cadherin表達(dá)缺失是HCC患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因素〔4〕。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2(FOXA2)屬于FOX基因超家族，其在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)研究證實(shí)FOXA2在許多人類腫瘤中表達(dá)缺失，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌和食管癌〔5〕。最近的研究表明FOXA2表達(dá)缺失促進(jìn)肺癌和胰腺癌EMT發(fā)生，抑制FOXA2導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)減少，而過表達(dá)FOXA2上調(diào)E-cadherin表達(dá)水平〔6，7〕。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測HCC及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中FOXA2與E-cadherin的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，探討FOXA2在HCC中表達(dá)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1一般資料 78例老年(年齡≥60歲)HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本來源于2008年1月至2012年10月在我院肝膽外科接受手術(shù)的肝癌患者，所有組織標(biāo)本都經(jīng)患者同意后取得?；颊吣?8例，女20例，年齡60～78〔平均(64.6±3.8)〕歲。所有標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為HCC。病理分級(jí)：Ⅰ+Ⅱ級(jí)36例，Ⅲ+Ⅳ級(jí)42例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期25例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，本課題通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2FOXA2和E-cadherin免疫組織化學(xué)染色 采用標(biāo)準(zhǔn)生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法對(duì)4 μm石蠟切片進(jìn)行染色。切片在60℃烤箱中烘烤60 min，然后經(jīng)二甲苯脫蠟和再水化，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)抗原熱修復(fù)，室溫冷卻20 min，0.3% Trixon-X100處理30 min，3%雙氧水-甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，正常血清封閉非特異性結(jié)合，切片經(jīng)FOXA2(1∶250，Abcam，Hong Kong)和E-cadherin(1∶400，BD Biosciences，USA)抗體4℃孵育過夜。沖洗后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗鼠二抗工作液(SP試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木蘇輕度復(fù)染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞內(nèi)棕色或棕黃色顆粒為蛋白陽性反應(yīng)，F(xiàn)OXA2表達(dá)主要定位在細(xì)胞核，E-cadherin表達(dá)主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：<10%=0分；10%～30%=1分；31%～50%=2分；>50%=3分，評(píng)分≥1分則認(rèn)為FOXA2或E-cadherin蛋白陽性表達(dá)〔8〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，分類資料采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1FOXA2和E-cadherin在HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá) 圖1可見，F(xiàn)OXA2和E-cadherin蛋白在HCC組織中的陽性表達(dá)率為44.9%(35/78)和52.6%(41/78)，而對(duì)應(yīng)癌旁組織中兩者表達(dá)率為71.8%(56/78)和74.4%(58/78)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.631，P=0.001；χ2=7.989，P=0.005)。

A：FOXA2在癌旁組織中陽性表達(dá)；B：FOXA2在HCC組織中陽性表達(dá)；C：FOXA2在HCC組織中陰性表達(dá)；D：E-cadherin在正常組織中陽性表達(dá)；E：E-cadherin在HCC組織中陽性表達(dá)；F：E-cadherin在HCC組織中陰性表達(dá)

2.2FOXA2與E-cadherin蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 HCC組織中FOXA2與E-cadherin蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.715，P=0.015)。

2.3FOXA2蛋白表達(dá)與HCC臨床病理特征的相關(guān)性 FOXA2蛋白表達(dá)與腫瘤數(shù)目(χ2=5.552，P=0.018)、血管侵犯(χ2=9.329，P=0.002)和TNM分期(χ2=6.479，P=0.011)有關(guān)，而與性別、HBV感染、AFP水平、腫瘤大小、肝硬化和病理分級(jí)無關(guān)。見表1。

表1 FOXA2蛋白表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性(n)

3 討 論

HCC是最常見的肝臟原發(fā)惡性腫瘤，是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，因此探索HCC早期診斷及預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物成為改善患者預(yù)后的關(guān)鍵〔9〕。Foxa1或者Foxa2基因敲除小鼠分別導(dǎo)致出生后死亡或胚胎死亡，單獨(dú)或聯(lián)合敲除Foxa1和Foxa2證實(shí)兩者對(duì)于內(nèi)胚層來源細(xì)胞的終末分化和成熟十分重要，如內(nèi)分泌胰腺的α細(xì)胞，肝臟、肺泡和前列腺腔導(dǎo)管上皮，提示FOXA1/2蛋白對(duì)于早期胚胎發(fā)育和晚或終末期上皮分化具有決定性作用〔10〕。研究證實(shí)在FOXA2在分化不良的胰腺癌中表達(dá)水平顯著低于分化良好的腫瘤，另外在FOXA2在間質(zhì)型肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于上皮性肺癌細(xì)胞〔6，7〕。本研究提示FOXA2與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，F(xiàn)OXA2可能作為潛在的預(yù)測腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和患者生存期的分子標(biāo)志物。

E鈣黏蛋白(E-cadherin)是鈣黏蛋白家族主要成員之一，負(fù)責(zé)上皮細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附功能，已經(jīng)有研究認(rèn)為鈣黏蛋白的正常功能缺失可能是腫瘤細(xì)胞去分化以及導(dǎo)致轉(zhuǎn)移潛能增加的重要步驟〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin在HCC組織中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，這與之前的研究報(bào)道一致〔4〕。最近研究在肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)能夠下調(diào)FOXA2蛋白水平，過表達(dá)FOXA2可以減少腫瘤侵襲和抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)(EMT)〔6〕。另外研究也發(fā)現(xiàn)FOXA1/2缺失在胰腺癌EMT過程中發(fā)揮重要作用〔7〕。E-cadherin表達(dá)減少或缺失是EMT的重要標(biāo)志之一〔2〕，本研究提示FOXA2可能通過抑制EMT發(fā)揮抑制HCC轉(zhuǎn)移的功能。

綜上所述，F(xiàn)OXA2和E-cadherin在HCC組織中表達(dá)下調(diào)且兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān)，F(xiàn)OXA2低表達(dá)與HCC惡性臨床病理特征相關(guān)，提示FOXA2可能作為HCC潛在的治療靶點(diǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

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