王琳娜 李強(qiáng)翔 楊山華

(河南省中醫(yī)院腎內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

腎小管間質(zhì)損害是影響腎臟疾病進(jìn)展和預(yù)后的重要因素，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的下游介質(zhì)，有促進(jìn)細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成的作用,細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分包括Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型膠原和纖維黏連蛋白(FN)。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型是以進(jìn)行性小管間質(zhì)纖維化為特征的實(shí)驗(yàn)性腎病模型。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)可延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展,對(duì)此國內(nèi)外有不同的報(bào)道〔1，2〕。低分子量肝素有抗凝、抗血栓和改善微循環(huán)的作用，并能減輕蛋白尿和延緩腎小球硬化。本實(shí)驗(yàn)通過低分子肝素和依那普利的聯(lián)合治療觀察兩者聯(lián)合使用對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織CTGF表達(dá)和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響，探討兩者聯(lián)用抗腎間質(zhì)纖維化機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量180～220 g,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。分成UUO模型組、依那普利組、低分子肝素組、低分子肝素+依那普利聯(lián)合組各8只和假手術(shù)組(8只)。UUO模型的制備：10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后,無菌手術(shù)操作打開腹腔,分離左輸尿管,用4-0號(hào)線雙重結(jié)扎并離斷輸尿管,分層縫合關(guān)閉腹腔;假手術(shù)組只分離輸尿管后即關(guān)閉腹腔。每組大鼠于UUO后第14天處死,留取梗阻側(cè)腎組織備用。依那普利組自術(shù)前24 h開始給予依那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃,直至造模后第14天；低分子肝素組自術(shù)前24 h開始給以低分子肝素鈣410 U/kg皮下注射，每天2次直至造模后第14天；聯(lián)合組給予上述兩種治療聯(lián)用；UUO模型組和假手術(shù)組只給同量生理鹽水灌胃和生理鹽水皮下注射。

1.2主要材料 馬來酸依那普利購自江蘇揚(yáng)子江制藥股份有限公司,低分子肝素鈣購自葛蘭素史克有限公司組織，總RNA提取試劑盒(RNeasyMini Kit試劑盒)購自美國Qiangen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司,real-time PCR試劑盒(q-PCR Mixture)購自日本TaKaRa公司,熒光探針實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI 7900HT)購自美國Applied Biosystems公司,real-time PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成,羊抗CTGF多克隆抗體購自美國Abcam公司，鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司,二抗均購自美國Sigma公司,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液購自美國Pierce公司。

1.3觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1腎臟組織HE染色 腎組織以4%多聚甲醛固定,常規(guī)包埋、切片,做HE染色觀察腎組織病理變化,每張標(biāo)本低倍鏡下單盲依序觀察左上、右上、左下、右下、中間5個(gè)腎小管間質(zhì)視野,依據(jù)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等8項(xiàng)指標(biāo)來觀察腎間質(zhì)病理改變并進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分〔3〕。

1.3.2腎臟組織Masson染色 腎組織以4%多聚甲醛固定,常規(guī)包埋、切片,做Masson染色觀察腎組織病理變化膠原的沉積,每例切片低倍鏡下觀察10個(gè)互不重疊腎小管間質(zhì)視野，計(jì)算每例切片腎間質(zhì)Masson染色陽性面積占整個(gè)視野百分比，以對(duì)腎間質(zhì)膠原含量進(jìn)行半定量分析〔4〕。計(jì)分如下：0分：無著色；1分：輕度<10%；2分：中度：11%～25%；3分：重度：26%～50%；4分：極重度：>50%。

1.3.3CTGF和Ⅰ型膠原的Real-time PCR檢測(cè)

1.3.3.1組織總RNA的提取 依照Werbrock等〔5〕報(bào)道的方法,用RNeasyMini Kit試劑盒提取組織總RNA,抽提的總RNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD值,比值在1.9～2.0之間,取3 μl RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳,可見5 S,18 S,28 S 3條清晰的RNA帶,提示RNA無污染和降解。

1.3.3.2cDNA的合成 按O’Neill等〔6〕報(bào)道的方法,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,再以此cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)操作。Real-time PCR的引物序列如下:β-actin 上游5′-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3′,下游5′-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3′;CTGF上游5′-CCTGTGAAGCTGACCTAGAGGAAA-3′,下游5′-ACA-GAACTTAGCCCGGTAGGTCTT-3′；Ⅰ型膠原上游5′-TCAGGGGCGAAGGCAACAGT-3′，下游5′- TTGGGATGGAGGGAGTTTACACGA-3′。

1.3.3.3Real-time PCR檢測(cè) 在ABI 7900型熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,96孔板加樣,設(shè)計(jì)復(fù)孔和標(biāo)準(zhǔn)曲線,用Se-quence Detection System軟件分析各檢測(cè)樣本的Ct值(達(dá)到一定熒光閾值的循環(huán)數(shù)),計(jì)算2-ΔΔCt評(píng)價(jià)CTGF在腎組織中的表達(dá)水平。

1.3.4腎組織CTGF蛋白的Western印法檢測(cè)

1.3.4.1腎皮質(zhì)總蛋白質(zhì)的提取 取組織塊100 mg加入組織總蛋白提取液1 ml勻漿,冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,取上清,按Bio-rad蛋白定量試劑盒方法進(jìn)行蛋白定量,取80 μl上清加5×變性緩沖液20 μl混勻,100 ℃下變性10 min。

1.3.4.2免疫印跡檢測(cè) 灌制10%的分離膠和4%的堆積膠,取總蛋白100 μg行上樣電泳,電泳結(jié)束后260 mA電轉(zhuǎn)印90 min至PVDF膜。封閉液(5%牛奶)搖床上封閉2 h,加入羊抗CTGF多克隆抗體(1∶200),4℃搖床過夜。洗膜后再加相應(yīng)的二抗,室溫孵育1 h,加ECL液后顯影、定影,以β-actin為內(nèi)參照。將膠片掃描后,采用Quantity One軟件分析各條帶灰度值,將各目的條帶灰度值除以同一標(biāo)本內(nèi)參照β-actin條帶灰度值得到一比值,將該比值除以同一膠片上假手術(shù)組的比值作為該目的蛋白表達(dá)量的半定量結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HE染色 假手術(shù)組腎臟未見明顯病變,模型組UUO術(shù)后第14天,大體觀腎皮質(zhì)變薄,鏡下見腎小管上皮細(xì)胞空泡變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分小管萎縮,遠(yuǎn)曲小管、集合管呈囊狀擴(kuò)張,部分近端小管保存尚好,間質(zhì)可見成纖維細(xì)胞增殖和纖維化。低分子肝素治療組術(shù)后第14天,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減輕,但腎小管上皮細(xì)胞變性、腎小管擴(kuò)張及萎縮和間質(zhì)纖維化程度與模型組相比無明顯差別；依那普利組術(shù)后第14天,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕,腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴(kuò)張及萎縮及間質(zhì)纖維化程度有所減輕；聯(lián)合組術(shù)后第14天，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減輕,腎小管上皮細(xì)胞變性、腎小管擴(kuò)張及萎縮和間質(zhì)纖維化程度明顯減輕，與模型組相比均有明顯好轉(zhuǎn)。對(duì)HE染色進(jìn)行腎間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分。見表1。

表1 各組大鼠腎間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分±s，n=8)

2.2梗阻側(cè)腎組織膠原相對(duì)面積 假手術(shù)組腎小球基底膜、腎小管基底膜、系膜基質(zhì)染成綠色，腎間質(zhì)無明顯膠原纖維；模型組腎間質(zhì)可見大量染成綠色的膠原纖維；低分子肝素組、依那普利組和聯(lián)合組腎間質(zhì)可見少量染成綠色的膠原纖維。對(duì)Masson染色進(jìn)行腎間質(zhì)膠原相對(duì)面積評(píng)分。見表1。

2.3Real-time PCR結(jié)果 UUO術(shù)后14 d,腎組織CTGF和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)較模型組明顯增多。經(jīng)低分子肝素和依那普利治療后,腎組織CTGF和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)均較模型組有所減少(P<0.05)。聯(lián)合組CTGF和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)與模型組比較有明顯降低(P<0.05)；與低分子肝素組和依那普利組比較，聯(lián)合組CTGF和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)有明顯降低(P<0.05)；低分子肝素組和依那普利單獨(dú)治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2

表2 各組大鼠腎組織CTGF和Ⅰ型膠原 mRNA的表達(dá)±s，n=8)

2.4Western印跡法結(jié)果 與假手術(shù)組大鼠相比,模型組UUO術(shù)后14 d CTGF蛋白表達(dá)增加,低分子肝素和依那普利組后,腎組織CTGF蛋白的表達(dá)均較模型組減少(P<0.05)；聯(lián)合組CTGF的表達(dá)與模型組比較有明顯降低(P<0.05)；與低分子肝素組和依那普利組比較，聯(lián)合組CTGF的表達(dá)有明顯降低(P<0.05)；低分子肝素組和依那普利單獨(dú)治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

1假手術(shù)組;2模型組;3低分子肝素組；4依那普利組；5聯(lián)合組

3 討 論

CFGF是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，廣泛存在于人類多種組織器官中，尤以腎臟中含量最高。CTGF因種類不同，表現(xiàn)不同的生物學(xué)效應(yīng)，在腎臟中，CTGF對(duì)腎臟多種固有細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞有促增殖和促ECM合成的作用〔7〕。CTGF作為TGF-β的下游介質(zhì)，在TGF-β的誘導(dǎo)下，由成纖維細(xì)胞分泌，介導(dǎo)TGF-β發(fā)揮促有絲分裂、細(xì)胞趨化、誘導(dǎo)黏附、細(xì)胞增殖和ECM合成等作用，而對(duì)TGF-β的抗炎、抗細(xì)胞分化作用無影響〔8〕。低分子肝素有抗凝、抗血栓和改善微循環(huán)的作用，并能減輕蛋白尿和延緩腎小球硬化〔9，10〕。

本研究前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)依那普利對(duì)腎間質(zhì)纖維化有防治作用,依那普利的抗纖維化作用在UUO術(shù)后14 d內(nèi)效果好,這一作用機(jī)制與依那普利拮抗UUO早期血流動(dòng)力學(xué)改變和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活有關(guān),進(jìn)而抑制TGF-β1 / Smad通路的活化及腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LMWH和依那普利聯(lián)合應(yīng)用能明顯減輕腎間質(zhì)膠原沉積程度，減少損傷腎組織GTGF和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)，聯(lián)合用藥的治療作用優(yōu)于低分子肝素和依那普利的單獨(dú)應(yīng)用，抗纖維化作用可能與抑制腎間質(zhì)GTGF的表達(dá)，從而抑制膠原成分的合成有關(guān)。低分子肝素和依那普利組間比較結(jié)果顯示，依那普利抗纖維化作用稍優(yōu)于低分子肝素，這一作用可能與依那普利作為RAAS系統(tǒng)阻斷劑的降壓作用相關(guān)。本試驗(yàn)僅觀察至UUO術(shù)后14 d，隨著纖維化進(jìn)程的延長(zhǎng)，RAAS系統(tǒng)激活在腎間質(zhì)纖維化的致病過程中所起的作用逐漸退居其次，依那普利抗纖維化作用不再突出。低分子肝素和依那普利的聯(lián)合用藥能通過多個(gè)靶點(diǎn)起到抗纖維化作用，隨著纖維化進(jìn)程的延長(zhǎng)，抗纖維化作用可能逐漸顯著。抗纖維化研究的觀察時(shí)間點(diǎn)及低分子肝素安全的劑量范圍有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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