李彩麗 魏虎來 陳 靜 黃雙盛 李永泉 田寶瑩

(西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，甘肅 蘭州 730030)

自噬是指當(dāng)個(gè)體細(xì)胞遇到生存壓力(如營(yíng)養(yǎng)缺乏、環(huán)境刺激、藥物等)時(shí)，細(xì)胞通過雙層膜將受損、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子以及入侵的物質(zhì)包裹形成直徑約400～900 nm大小的自噬小體，接著自噬小泡的外膜與溶酶體膜融合，并最終在一系列水解酶的作用下將其降解，從而為細(xì)胞的重建、再生和修復(fù)提供必需原料，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)和再利用，以保全其他細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制〔1〕。因此，自噬可作為一種防御機(jī)制來抵御環(huán)境變化對(duì)細(xì)胞造成的損傷。三氧化二砷(As2O3)在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病方面有良好的殺傷效應(yīng)及特異的作用機(jī)制。近年來，As2O3在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用方面均顯示其具有較廣譜的抗腫瘤效應(yīng)。然而，As2O3在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，還對(duì)人體具有免疫抑制和免疫毒性作用〔2，3〕,但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過觀察自噬與凋亡在As2O3抑制淋巴細(xì)胞(PBL)增殖過程中的作用,探討As2O3的免疫毒性作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 As2O3為Sigma公司產(chǎn)品，配成10 mmol/L貯備液；3-甲基腺嘌呤(3-MA)購(gòu)自Sigma公司，用PBS配成100 mmol/L的貯備液；單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染料用PBS 配成1.5 mmol/L的貯備液；Annexin-V/PI雙標(biāo)記染色試劑盒購(gòu)自上海凱基公司；蛋白抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司；兔抗人Beclin-1一抗和鼠抗兔二抗均為Cell Signaling 公司產(chǎn)品； MTT和RPMI 1640均為Sigma公司產(chǎn)品；無噬菌體胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所；淋巴細(xì)胞分離液(武漢博士德生物公司)。

1.2方法

1.2.1PBL分離與培養(yǎng) 抽取健康人靜脈血10 ml,肝素鈉抗凝，用RPMI1640或PBS以等體積稀釋，將稀釋后的血液沿管壁緩慢加到含等量淋巴細(xì)胞分離液的液面上，室溫離心2 000 r/min，20 min，吸取中間界面層單個(gè)核細(xì)胞。用RPMI1640洗2次，每次1 500 r/min，10 min，用1%的臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。細(xì)胞按5×105/ml接種于含15%胎牛血清的RPM 1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，接種96孔板，分組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別加入1，2，4，8 μmol/LAs2O3，其中抑制自噬組用4 mmol/L 3-MA預(yù)先處理細(xì)胞2 h后再加入As2O3處理細(xì)胞，培養(yǎng)不同時(shí)間后，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加10%SDS過夜，以570 nm為測(cè)試波長(zhǎng)，讀取吸光度A 值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3Annexin-V/PI雙標(biāo)記染色檢測(cè)凋亡 按文獻(xiàn)〔4〕收集細(xì)胞,PBS洗滌。用500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,避光室溫放置10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。

1.2.4MDC熒光染色檢測(cè)細(xì)胞自噬 按文獻(xiàn)〔5〕的方法收集細(xì)胞，PBS洗2次除去含血清的培養(yǎng)基，用0.05 mmol/L MDC于37℃避光孵育1 h后，PBS洗2次，用涂片離心機(jī)涂片后熒光顯微鏡觀察和攝片。

1.2.5電鏡觀察細(xì)胞自噬和凋亡超微結(jié)構(gòu) 按文獻(xiàn)〔6〕的方法收集細(xì)胞，以2 000 r/min離心15～20 min,棄上清，4℃預(yù)冷的PBS洗3次。沿管壁緩慢加入3%戊二醛固定液，在4℃環(huán)境中靜置30～60 min，冷PBS洗3次，1%四氧化鋨4℃再固定15～30 min，梯度丙酮溶液逐級(jí)脫水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡及自噬的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.6Bcl-2蛋白表達(dá)水平測(cè)定 收集細(xì)胞，PBS洗滌。分別加入細(xì)胞固定劑和通透劑，再加入FITC標(biāo)記的鼠抗人Bcl-2單抗染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠IgG1同型抗體為對(duì)照，F(xiàn)CM檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1As2O3對(duì)正常淋巴細(xì)胞的損傷作用 1.0～8.0 μmol/L As2O3對(duì)正常人PBL均有抑制作用，并呈濃度與時(shí)間依賴關(guān)系，As2O3作用24 h、48 h的IC50分別為12、46、3.76 μmol/L，見表1。

2.2As2O3誘導(dǎo)正常淋巴細(xì)胞發(fā)生自噬 MDC是一種熒光染料，能選擇性與自噬泡結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光。用5 μmol/L As2O3作用正常PBL 48 h后，用MDC染色，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)有大量點(diǎn)塊狀熒光結(jié)構(gòu)，較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)，和透射電鏡結(jié)果一致。見圖1。

圖1 As2O3誘導(dǎo)的PBL自噬改變

2.33-MA抑制自噬促進(jìn)As2O3對(duì)淋巴細(xì)胞的損傷效應(yīng) 3-MA是自噬的特異性抑制劑。通過3-MA抑制As2O3誘導(dǎo)的自噬后，PBL細(xì)胞存活率較抑制前明顯下降，24 h、48 h的IC50分別由抑制前的12.46 μmol/L和3.76 μmol/L下降為抑制后的10.40 μmol/L和2.31 μmol/L。見表1。

2.43-MA抑制自噬增強(qiáng)As2O3誘導(dǎo)的PBL凋亡 5 μmol/L As2O3作用48 h可誘導(dǎo)PBL細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡率為41.4%；電鏡下細(xì)胞出現(xiàn)胞體變形、核固縮、常異染色質(zhì)分離呈新月形等凋亡改變，同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)有自噬體形成，MDC染色胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)多量點(diǎn)塊狀綠色熒光。用3-MA抑制自噬后，發(fā)現(xiàn)5 μmol/L As2O3誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞較抑制前明顯增多，凋亡率增至60.3%；細(xì)胞凋亡形態(tài)特征較自噬抑制前更加顯著，但細(xì)胞內(nèi)自噬體則明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明As2O3可誘導(dǎo)PBL發(fā)生自噬性死亡，抑制自噬可促進(jìn)As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.53-MA抑制自噬對(duì)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響 Bcl-2 是一種細(xì)胞凋亡抑制因子，具有抑制細(xì)胞凋亡的功能。5 μmol/L As2O3處理48 h后，PBL細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(29.3%)和平均熒光強(qiáng)度(MFI=1.77)較對(duì)照(49.0%，1.91)降低。用3-MA抑制自噬后再用5 μmol/L As2O3處理細(xì)胞，Bcl-2蛋白表達(dá)水平較抑制自噬前進(jìn)一步下降(17.9%，1.43)，提示3-MA有可能通過進(jìn)下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)而增加As2O3對(duì)PBL的損傷效應(yīng)。

表1 3-MA抑制自噬促進(jìn)As2O3誘導(dǎo)的PBL損傷±s，n=6)

圖2 3-MA對(duì)As2O3誘導(dǎo)的PBL自噬與凋亡形態(tài)改變的影響

3 討 論

自噬是細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的一種防御機(jī)制,同時(shí)自噬還參與多種疾病的病理過程〔7〕。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞受到化療藥物等刺激時(shí),可觀察到細(xì)胞的自噬功能增強(qiáng)〔8〕，此時(shí)，細(xì)胞通過啟動(dòng)自噬來清除受損線粒體,可保護(hù)細(xì)胞免于凋亡和壞死的危險(xiǎn),但當(dāng)自噬能力不足時(shí),線粒體凋亡因子將激活凋亡途徑。

淋巴細(xì)胞是免疫調(diào)控的主要群體，其活化/死亡對(duì)人體免疫功能有重要的影響。As2O3是目前臨床上廣泛使用的較廣譜的抗腫瘤藥物，大量研究表明，As2O3的抗腫瘤效應(yīng)主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔9〕，近年來的研究還顯示As2O3在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)還可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬〔10〕。盡管對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)和較特異的殺傷效應(yīng)，但也同時(shí)對(duì)正常淋巴細(xì)胞具有一定的損傷作用，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制或免疫毒性作用〔2，3〕，As2O3損傷淋巴細(xì)胞的具體機(jī)制尚不清楚。本文研究證實(shí)As2O3對(duì)正常外周血淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒效應(yīng)，抑制淋巴細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡；同時(shí)發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生明顯的自噬反應(yīng)。若采用3-MA抑制細(xì)胞自噬，As2O3對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，Bcl-2的表達(dá)水平降低。提示細(xì)胞自噬活性是一種保護(hù)機(jī)制,可抑制As2O3對(duì)外周血淋巴細(xì)胞造成的損傷。

綜上所述，As2O3對(duì)正常淋巴細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡而損傷正常淋巴細(xì)胞，細(xì)胞自噬活化可抑制As2O3對(duì)淋巴細(xì)胞的損傷作用，有利于抵御As2O3對(duì)機(jī)體的免疫毒性效應(yīng)。

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