黃銀久 胡小梅 唐 潔 劉 浩 丁一博 何鮦鮦 劉培培 王雪粉

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，安徽 蚌埠 233030)

乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷是提高乳腺癌療效的關(guān)鍵。醫(yī)學(xué)上往往根據(jù)腫瘤分期對已發(fā)乳腺癌患者采取綜合治療的方案〔1〕。對于中晚期乳腺癌轉(zhuǎn)移擴散患者往往采取手術(shù)后放化療的手段，其中以表柔比星為代表的蒽環(huán)類單藥或聯(lián)合化療方案和紫杉醇(Taxol)為代表的紫衫類單藥或聯(lián)合化療方案為主〔2,3〕。本文以高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435為研究對象，從療效和毒性等方面評價表柔比星、紫杉醇、奧沙利鉑、羥喜樹堿的體外抗癌活性。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞系和試劑 MDA-MB-435細(xì)胞由陳超老師饋贈(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系)；DMEM 培養(yǎng)基(GIBICO)；胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT,Trypsine (SIGMA)；乳酸脫氫酶試劑盒(LDH)(南京建成生物工程研究所)；表柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；紫杉醇( 深圳萬樂藥業(yè)有限公司)；奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；羥喜樹堿(黃石飛云制藥有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和藥物作用 MDA-MB-435細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基、37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換一次培養(yǎng)液，4～6 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞為實驗對象。實驗藥物以生理鹽水為溶劑，配成40 mmol/L作為儲備液，在使用前，直接用培養(yǎng)基將其稀釋到作用濃度，生理鹽水作為對照組。

1.3方法 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.025%胰蛋白酶常規(guī)消化后，重懸于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞種在96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl細(xì)胞懸液含 3.5×104個細(xì)胞， 最右一排孔為空白對照組，加同體積完全培養(yǎng)基。置于5% CO2、37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁。去除培養(yǎng)基，加入含不同藥物的完全培養(yǎng)基，每孔200 μl，空白對照組每孔加200 μl完全培養(yǎng)基。利用MTT比色法，在A595波長下測OD值，計算抑制率，計算公式：

抑制率(%)=(1-藥物處理OD值/陰性對照組OD值)×100%。同樣處理細(xì)胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加等體積的生理鹽水，分別處理12、24、36、48、60、72 h后，用倒置顯微鏡觀察藥物對細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響并拍照。同樣處理細(xì)胞，陰性對照組加生理鹽水。處理72 h，去除上清，每孔加100 μl的 0.5 mg/ml的MTT(溶解在1×PBS)，培養(yǎng)4.5 h后用倒置顯微鏡觀察甲瓚結(jié)晶生產(chǎn)情況。

1.4LDH活性測定 將正常培養(yǎng)的細(xì)胞以5×104cells/well的濃度接種到12孔板中，貼壁24 h后加藥物處理，設(shè)空白對照組、實驗組分為加藥孔、完全釋放孔(陽性對照組)、自然釋放孔(陰性對照組)。自然釋放孔和完全釋放孔分別加和藥物同體積的生理鹽水，作用24 h后，完全釋放孔加2% Triton X-100完全裂解細(xì)胞作為陽性對照。按照LDH試劑盒操作說明進(jìn)行操作和計算。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS11.5軟件運用One-Way ANOVA方法分析。

2 結(jié) 果

2.1四種抗腫瘤藥物的體外抗腫瘤效果 紫抗醇無論在1 μmol/L或者10 μmol/L濃度下對靶標(biāo)細(xì)胞都有較好的體外抑制活性，而表柔比星在1 μmol/L濃度下的抑制活性相對較低；與這兩個藥物相比， 奧沙利鉑的效果稍差， 而羥喜樹堿卻顯示出非常好的抑制活性，見表 1。

表1 四種藥物在 1 μmol/L 和10 μmol/L濃度下對MDA-MB-435細(xì)胞的體外抑制活性±s)

2.2四種化療藥物對MDA-MB-435細(xì)胞產(chǎn)生了不同的形態(tài)學(xué)影響 與生理鹽水對照組相比，表柔比星在1 μmol/L下，隨著作用時間延長細(xì)胞增殖減弱，同時細(xì)胞開始變形增大，在10 μmol/L濃度下對細(xì)胞作用36 h細(xì)胞裂解；而紫杉醇作用更加明顯，在1 μmol/L或10 μmol/L濃度下，作用細(xì)胞12 h，細(xì)胞皺縮變??；與表柔比星作用很相似，羥喜樹堿在1 μmol/L或10 μmol/L作用細(xì)胞24 h，細(xì)胞皺縮變??；與以上三個藥物不同，奧協(xié)利鉑無論在1 μmol/L或10 μmol/L作用細(xì)胞12～72 h，主要導(dǎo)致細(xì)胞增殖減弱，10 μmol/L濃度尤為明顯，見圖1。

圖1 四種藥物對MDA-MB-435細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響

2.3甲瓚結(jié)晶生成結(jié)果 圖2表明，與生理鹽水對照相比，表柔比星在10 μmol/L濃度下對靶標(biāo)細(xì)胞作用72 h，細(xì)胞基本完全死亡；而紫杉醇在1 μmol/L 或10 μmol/L濃度下細(xì)胞都基本死亡；與紫杉醇相似，羥基喜樹堿在1 μmol/L 或10 μmol/L細(xì)胞基本完全死亡，但在相應(yīng)濃度下毒性比Taxol輕；與以上三種化療藥物不同，奧沙利鉑顯示了很輕的細(xì)胞毒性。

圖2 四種藥物對MDA-MB-435細(xì)胞作用72 h后甲瓚結(jié)晶生成情況

2.4LDH活性檢測結(jié)果 表柔比星在低濃度下對靶標(biāo)細(xì)胞的毒性相對較小，在1～10 μmol/L下與陰性對照組相比P>0.05，與陽性對照組相比P<0.001；但是當(dāng)濃度增大對細(xì)胞的毒性明顯增大，在20～40 μmol/L下與陰性對照組相比P<0.001，與陽性對照組相比P<0.001；紫杉醇在所有的實驗濃度下都顯示出極大的細(xì)胞毒性，各濃度下與陰性對照組相比P<0.001，與陽性對照相比P>0.05或P<0.001。羥喜樹堿顯示了和紫杉醇極相似的細(xì)胞毒性。奧沙利鉑在實驗的各濃度下顯示了很低的細(xì)胞毒性，在所有的檢測濃度下和陰性對照組相比P>0.05，與陰性對照組相比P<0.002。

表2 四種藥物對MDA-MB-435細(xì)胞作用24 h后細(xì)胞毒作用比較±s,υ/L)

3 討 論

局部晚期乳腺癌發(fā)現(xiàn)時已非早期，蒽環(huán)類與紫杉類是其中最有效的兩類藥物〔4〕。表柔比星直接嵌入DNA堿基對之間，干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止mRNA的形成，從而抑制DNA和RNA的合成，為一細(xì)胞周期非特異性藥物；紫杉醇作用機制主要體現(xiàn)在通過打破微管和微管蛋白二聚體之間存在動態(tài)平衡，破壞細(xì)胞有絲分裂時紡錘絲和紡錘體的形成，從而抑制細(xì)胞的分裂和增殖。以上的實驗結(jié)果表明：紫杉醇的這種藥理作用明顯強于表柔比星的作用，由于考慮到這兩種藥物的作用機制不同，所以可以考慮把這兩種藥物聯(lián)合使用，更大的發(fā)揮抗癌作用〔5,6〕。與這兩種藥相比，羥喜樹堿和奧沙利鉑在相應(yīng)濃度下也具有很好的體外抑制活性。羥喜樹堿主要作用于S期，為細(xì)胞周期特異性藥物，對處于S期的細(xì)胞作用較G1期和G2期顯著。由于細(xì)胞S期受到干擾，核分裂受到抑制，阻止細(xì)胞進(jìn)入分裂期。結(jié)合上面的實驗結(jié)果，不難看出這一作用機制對腫瘤細(xì)胞的作用是很強烈的。與以上三種抗癌藥物相比，奧沙利鉑在實驗濃度下雖然顯示了相對較小的抑制活性，但是同時也表現(xiàn)出相對較小的細(xì)胞毒作用。有關(guān)奧沙利鉑的作用機制不完全清楚，它可以通過產(chǎn)生水化衍生物抑制DNA 的合成，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用和抗腫瘤活性。但是本實驗表明，奧沙利鉑很明顯的抑制了細(xì)胞的增殖，所以應(yīng)該從抑制細(xì)胞增殖的途徑對奧沙利鉑展開更廣泛和深入的研究。

4 參考文獻(xiàn)

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