李躍軍 卓德斌

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南 株洲 412000)

胃癌是我國(guó)高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是臨床治療胃癌常用的化療藥物，但有效率低，容易產(chǎn)生耐藥性，如何克服其耐藥是目前胃癌治療的難點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(乳腺癌耐藥蛋白ABCG2、P-糖蛋白MDR1)使腫瘤具有原發(fā)性多藥耐藥性，使腫瘤細(xì)胞能逃離多種化療藥物的毒性和殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外觀察5-Fu耐藥的CD44+ SGC-7901/5-Fu細(xì)胞株ABCG2、MDR1基因表達(dá)水平，初步探討其獲得性耐藥機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株及主要試劑 胃癌細(xì)胞株(SGC-7901)購(gòu)自中科院上海生物研究；5-Fu(Sigma，美國(guó))；鼠抗人CD44抗體(Biolegend，美國(guó))；MTT(Sigma，美國(guó))；胰蛋白酶 (Amreseo，美國(guó))；新生牛血清(Sigma，美國(guó))。RPMI-1640 (Gibco，美國(guó))。AnnexinⅤ-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備 生物安全柜(THERMO，美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱(德國(guó))；倒置顯微鏡 (OLYMPUS，日本)；酶標(biāo)儀(Biorad，美國(guó))；FACSAria流式細(xì)胞儀(Biolegend，美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%滅活小牛血清(FBS)和青、鏈霉素(100 U/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)SGC-7901。37℃、5%CO2，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每1～2 d換液。

1.3.25-Fu耐藥的SGC-7901/5-Fu胃癌細(xì)胞模型建立 采用反復(fù)大劑量沖擊結(jié)合逐步遞增藥物濃度法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞，加入5 mg/L 5-Fu，于37e、5% CO2、全濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，用不含Ca2+、P3-的磷酸鹽緩沖液 D-Hanks洗1次，將細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)藥RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后(7～10 d)，反復(fù)用5-Fu沖擊處理，同時(shí)逐漸增加藥物濃度(5、10、15、20、25、35、40)，經(jīng)過(guò)8次沖擊至5-Fu藥物濃度達(dá)40 mg/L，建立其耐藥細(xì)胞株 SGC7901/5-Fu。待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后將其維持培養(yǎng)于含5-Fu 10 mg/L的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，每 2～3 d傳代1次。撤藥2 w后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選CD44+SGC-7901/5-Fu細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901/5-Fu細(xì)胞，胰酶消化后用10%FBS DMEM/F12終止消化，2 500 r/min離心5 min后棄上清。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，重懸于含2%BSA的4℃預(yù)冷PBS中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L。取300 μl SGC-7901/5-Fu細(xì)胞，每100 μl細(xì)胞懸液加入CD44-FITC均勻混合，4℃避光孵育30 min后，PBS洗滌2次，2 500 r/min離心5 min后棄上清，將細(xì)胞沉淀懸浮于500 μl PBS中。使用FACSAria流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分選。

1.3.4MTT比色法測(cè)定耐藥指數(shù)及交叉耐藥性 分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901、SGC-7901/5-Fu、CD44+SGC-7901/5-Fu 、CD44-SGC-7901/5-Fu細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108cells/L。取各組細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，100 μl/孔孵育24 h后再加入8個(gè)倍比濃度梯度稀釋的5-Fu、ADM、MMC和DDP，調(diào)整每孔終體積至200 μl。以不加化療藥物的組作為對(duì)照組；僅加入200 μl RPMI-1640完全培養(yǎng)液為空白組。96孔培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育72 h后，每孔加入四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(5 g/L)20 μl，繼續(xù)孵育4 h后，2 000 r/min離心10 min，棄上清。每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀上以570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(A)值。細(xì)胞生存率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A平均組/對(duì)照組A平均值)×100%；以藥物濃度對(duì)數(shù)為橫軸，生存率為縱軸，做出量-效曲線，求得半數(shù)抑制率(IC50)，計(jì)算耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)(RF)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50。

1.3.5RT-PCR檢測(cè)ABCG2、MDR1 mRNA表達(dá)水平 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901、SGC-7901/5-Fu、CD44+SGC-7901/5-Fu 、CD44-SGC-7901/5-Fu細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)，采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，ABCG2、MDR1與β-actin mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為342 bp、237 bp與500 bp。ABCG2：正義5′-GCGACCTGCCAATTTCAAAT-3′，反義5′-AGCCAGTTGTAGGCTCATCCA-3′。MDR1：正義5′-CGCCAATGATGCTGCTCAAG-3′，反義5′-ACCAAGTAGGCTCCAAACCC-3′。β-actin正義5′-CAGGGTGTGATGGTGGG-3′，反義5′-GGAAGAGGATGCGGCAG-3′。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：模板cDNA1 μl，正、反義引物各0.5 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl、dNTPs(2 mmol/L)2.5 μl、MgCl2(25 mmol/L)3 μl、10×PCR Buffer 2.5 μl，ddH2O 14.7 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s。40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，Quantity One 圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描。ABCG2、MDR1 mRNA表達(dá)水平以各目的基因片段OD值/內(nèi)參照β-actin密度值表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞耐藥指數(shù)及交叉耐藥性比較 MTT法檢測(cè)CD44+SGC-7901/5-Fu相對(duì)于SGC-7901細(xì)胞的RF為12.5(P<0.05)，但CD44-SGC-7901/5-Fu相對(duì)于SGC-7901細(xì)胞的RF為1.2(P>0.05)。CD44+SGC-7901/5-Fu對(duì)ADM、MMC和DDP也有交叉耐藥性，CD44-SGC-7901/5-Fu對(duì)ADM、MMC和DDP無(wú)交叉耐藥性。見表1。

2.2各組細(xì)胞ABCG2、MDR1 mRNA表達(dá)水平 見表2。與對(duì)照組(正常SGC-790)細(xì)胞比較，ABCG2、MDR1在5-Fu耐藥的SGC-7901細(xì)胞株中表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。與5-Fu耐藥的SGC-7901細(xì)胞株比較，CD44+SGC-7901/5-Fu細(xì)胞株ABCG2、MDR1表達(dá)繼續(xù)增加(P<0.05)。與5-Fu耐藥的SGC-7901細(xì)胞株比較，CD44-SGC-7901/5-Fu細(xì)胞ABCG2、MDR1表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組細(xì)胞±s,mg/L)及交叉耐藥性

表2 各組ABCG2、MDR1 mRNA表達(dá)水平±s)

3 討 論

各研究表明，腫瘤耐藥細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞比例增加是腫瘤耐藥的主要原因，其機(jī)制與腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)ABCG2和MDR1密切相關(guān)〔1～5〕。近年的許多研究結(jié)果認(rèn)為CD44+胃癌細(xì)胞具有自我更新和分化能力，該亞群細(xì)胞是胃癌腫瘤干細(xì)胞，并且可能是腫瘤耐藥的主要原因〔6，7〕。 本研究表明，CD44+細(xì)胞較正常SGC7901細(xì)胞和CD44-細(xì)胞耐藥指數(shù)明顯增加，并呈現(xiàn)明顯多藥耐藥性，是SGC7901細(xì)胞中主要的耐藥細(xì)胞亞群。

ABCG2 能主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)多種化療藥物，將藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外。表達(dá)特征與惡性腫瘤化療效果有密切關(guān)系，高表達(dá)者化療效果不佳；低表達(dá)療效較好。研究發(fā)現(xiàn)ABCG2主要通過(guò)結(jié)合和水解并利用能量將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，降低胞內(nèi)藥物濃度和減輕細(xì)胞毒作用，從而可使機(jī)體對(duì)抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥〔8，9〕。

MDR1基因編碼的P-g(P-糖蛋白)是一種三磷酸腺苷(ATP)依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)排出泵，有與ATP結(jié)合的位點(diǎn)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞與抗腫瘤藥物接觸，脂溶性藥物隨濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，P-gp即與藥物分子結(jié)合并連接ATP位點(diǎn)，形成1個(gè)磷酸化和糖基化ATP-結(jié)合盒蛋白的藥物大分子。當(dāng)ATP水解，釋放的能量將已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物從胞內(nèi)泵出胞外，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低。腫瘤細(xì)胞耐藥程度、胞內(nèi)藥物濃度與胞膜表面的MDR1表達(dá)密切相關(guān)，抑制MDR1基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性〔8，10〕。

Zhou等〔4〕發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞系PANC1中腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)MDR1和ABCG2，推測(cè)是PANC1腫瘤干細(xì)胞耐藥的主要原因。Zheng等〔5〕發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌多柔比星耐藥細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞比例及MDR1、ABCG2表達(dá)明顯升高，抑制腫瘤干細(xì)胞MDR1、ABCG2可增加其對(duì)多柔比星的敏感性。CD44+SGC-7901/5-Fu細(xì)胞株ABCG2、MDR1 mRNA表達(dá)較正常SGC-7901細(xì)胞株及5-Fu耐藥的SGC-7901/5-Fu細(xì)胞株明顯增強(qiáng)，可能是其獲得性耐藥的原因，值得進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1Rizzo S，Hersey JM，Mellor P,etal. Ovarian cancer stem cell-like side populations are enriched following chemotherapy and overexpress EZH2〔J〕.Mol Cancer Ther， 2011；10(2)：325-35.

2Tsai LL，Yu CC，Chang YC,etal. Markedly increased Oct4 and Nanog expression correlates with cisplatin resistance in oral squamous cell carcinoma〔J〕. J Oral Pathol Med，2011；40(8)：621-8.

3Du Z，Qin R，Wei C,etal. Pancreatic cancer cells resistant to chemoradiotherapy rich in “stem-cell-like” tumor cells〔J〕. Dig Dis Sci， 2011；56(3)：741-50.

4Zhou J，Wang CY，Liu T,etal. Persistence of side population cells with high drug efflux capacity in pancreatic cancer〔J〕. World J Gastroenterol，2008；14(6)：925-30.

5Zheng X，Cui D，Xu S,etal. Doxorubicin fails to eradicate cancer stem cells derived from anaplastic thyroid carcinoma cells：characterization of resistant cells〔J〕. Int J Oncol，2010；37(2)：307-15.

6Hung JY，Yang CJ，Tsai YM，etal. Antiproliferative activity of paeoniflorin is through cell cycle arrest and the Fas /Fas ligand-mediated apoptotic pathway in human non-small cell lung cancer A549 cells〔J〕. Clin Exp Pharmacol Physiol，2008；35(2)：141-7.

7Sun M，Zhou W，Zhang YY，etal. CD44+ gastric cancer cells with stemness properties are chemoradioresistant and highly invasive〔J〕. Oncol Lett，2013；5(6)：1793-8.

8Moitra K，Lou H，Dean M. Multidrug efflux pumps and cancer stem cells：insights into multidrug resistance and therapeutic development〔J〕. Clin Pharmacol Ther，2011；89(4)：491-502.

9Nakanishi T，Ross DD. Breast cancer resistance protein(BCRP/ABCG2)：its role in multidrug resistance and regulation of its gene expression〔J〕. Chin J Cancer，2012；31(2)：73-99.

10許景峰. 腫瘤細(xì)胞MDR1基因多藥耐藥的研究進(jìn)展〔J〕. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010；26(5)：453-5.