孫相華 洪文娟 洪志鵬 周 菊 祝艷翠 王亞麗

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部醫(yī)療科，云南 昆明 650032)

缺氧是引起機(jī)體損傷的最常見(jiàn)因素之一，缺氧可以導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮出現(xiàn)明顯損傷，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞附于血管腔內(nèi)壁，它可以分泌多種血管活性物質(zhì)，如果血管內(nèi)皮損傷或功能異常，會(huì)發(fā)生心腦血管疾病。此外，缺氧還會(huì)導(dǎo)致肺部血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放內(nèi)皮素(ET)-1升高，并且激活鈣通道或磷脂酰肌醇系統(tǒng)，引起細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)過(guò)量的鈣，從而使細(xì)胞受到損害〔1〕。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的場(chǎng)所，同時(shí)線粒體也參與細(xì)胞凋亡，線粒體受到破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線粒體膜電位(MMP)是用來(lái)評(píng)價(jià)線粒體功能的指標(biāo)之一〔2〕。Ghrelin是從大鼠胃黏膜提取出的，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHSR)的內(nèi)源性配體〔3〕。本研究采用細(xì)胞缺氧模型研究缺氧對(duì)人肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP的影響及Ghrelin的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 二甲基亞砜(BIO RAD公司)，Ghrelin(Phoenix Pharmaceutical公司)，胰蛋白酶(華美生物工程公司)，人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(C-008-5C)(美國(guó)Cascade Biologies)，Medium200培養(yǎng)基(M-200-500)(Cascade Biologies公司)，一氧化氮(NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Asheville1NC公司)，ET放免試劑盒(亞法生物公司)，激光共聚焦顯微鏡(MRC21024，美國(guó)BIO RAD公司)，缺氧通氣環(huán)(自制)。

1.2制作缺氧通氣環(huán) 將內(nèi)徑1.2 mm的金屬銅管按照培養(yǎng)皿內(nèi)徑大小作成環(huán)狀管，使其緊貼在培養(yǎng)皿內(nèi)壁。然后在環(huán)形管上制出分布均勻的多個(gè)微小細(xì)孔，用來(lái)通氣。封閉環(huán)狀管的一端，用直徑相等塑料導(dǎo)管連接另一端，然后通過(guò)這個(gè)塑料導(dǎo)管連接到氮氧混合氣罐上。

1.3人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代接種 凍存的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞采用常規(guī)的方法復(fù)蘇，用培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整到適合濃度后接種到無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。細(xì)胞傳到第3代的時(shí)候，按1×105/mm的密度接種到培養(yǎng)皿后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 將人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分為3組：①對(duì)照組：只加入細(xì)胞培養(yǎng)液；②單純?nèi)毖踅M：加入細(xì)胞培養(yǎng)液，并進(jìn)行缺氧因素干預(yù)；③缺氧+Ghrelin組：加入含有1.0×10-7mol/L Ghrelin的細(xì)胞培養(yǎng)液，再進(jìn)行缺氧因素干預(yù)。

1.5MMP測(cè)定 ①將細(xì)胞用Hanks液洗3遍，加入800 μl無(wú)血清培養(yǎng)液至培養(yǎng)皿中；再加入2 μl的羅丹明123，在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，然后用Hanks液洗3遍，加入1.5 ml無(wú)血清培養(yǎng)液，然后在激光共聚焦顯微鏡下采集細(xì)胞。②用激光共聚焦顯微鏡掃描已標(biāo)記的細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞掃描200 s，然后測(cè)定每個(gè)標(biāo)記細(xì)胞MMP值。在細(xì)胞培養(yǎng)皿中放置缺氧環(huán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理，然后用激光共聚焦顯微鏡掃描缺氧后的細(xì)胞，同時(shí)測(cè)定每個(gè)標(biāo)記細(xì)胞缺氧后MMP值。③記錄缺氧前、后的最大值熒光值，作為被標(biāo)記細(xì)胞缺氧前后MMP值。

1.7細(xì)胞上清液ET-1含量測(cè)定 分別取100 μl培養(yǎng)細(xì)胞上清液，按照ET-1測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)處理上清液后應(yīng)用放射免疫伽瑪計(jì)數(shù)器檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組MMP變化 與對(duì)照組〔(35.46±3.08)Δφm〕比較，單純?nèi)毖踅MMMP水平〔(27.89±3.76)Δφm〕明顯降低(P<0.05)。與單純?nèi)毖踅M比較，缺氧+Ghrelin組內(nèi)皮細(xì)胞MMP水平〔(32.89±2.18)Δφm〕明顯升高(P<0.05)。對(duì)照組和缺氧+Ghrelin組內(nèi)皮細(xì)胞MMP水平無(wú)顯著差別(P>0.05)。

2.2各組細(xì)胞培養(yǎng)液ET-1含量比較 單純?nèi)毖踅M上清液ET-1水平〔(113.65±11.98)pg/ml〕高于對(duì)照組〔(42.85±6.12)pg/ml〕(P<0.05)，缺氧+Ghrelin組上清液ET-1水平〔(68.21±8.18)pg/ml〕明顯低于單純?nèi)毖踅M(P<0.05)。

2.3各組細(xì)胞培養(yǎng)液NO含量比較 單純?nèi)毖踅M〔(23.78±4.36)μmol/L〕、缺氧+Ghrelin組上清液NO水平〔(48.18±7.69)μmol/L〕明顯低于對(duì)照組〔(59.38±9.28)μmol/L〕(P<0.05)，缺氧+Ghrelin組上清液NO水平明顯高于單純?nèi)毖踅M(P<0.05)。

3 討 論

血管內(nèi)皮完整性對(duì)于機(jī)體保持內(nèi)皮的生物學(xué)功能非常重要。血管內(nèi)皮不僅是血液與組織間屏障，同時(shí)還具有多種其他功能，主要包括維持血管通透性，調(diào)節(jié)組織與血液間物質(zhì)交換；合成和分泌一些血管活性因子，調(diào)節(jié)血管舒縮功能；參與機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)等功能。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙，它是引起動(dòng)脈粥樣硬化的因素之一，同時(shí)其與高血壓、冠心病、高膽固醇血癥、心力衰竭、糖尿病等發(fā)生有關(guān)。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮和內(nèi)皮細(xì)胞功能是目前防治心腦血管疾病的研究熱點(diǎn)之一。內(nèi)皮細(xì)胞受損主要會(huì)影響內(nèi)皮依賴(lài)性舒張因子(EDRF) 和內(nèi)皮依賴(lài)性收縮因子(EDGF)，如NO分泌減少或生物利用度降低，而ET-1等分泌增加等，NO可以維持內(nèi)皮依賴(lài)性舒張活性，降低內(nèi)皮系統(tǒng)通透性，進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移和增殖，同時(shí)還可以抑制血小板聚集及白細(xì)胞和單核細(xì)胞黏附。ET-1是引起血管收縮的物質(zhì)，ET-1過(guò)多分泌對(duì)血管的影響主要為：長(zhǎng)期收縮血管、促進(jìn)有絲分裂及血小板和單核巨噬細(xì)胞聚集、粘附等的作用。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致氧自由基生成增加，NO分泌將減少，ET-1釋放增多。NO和ET-1是在血管壁分泌的并發(fā)揮著非常重要作用，因此其異常會(huì)引發(fā)血管病變，從而會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和高血壓等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展〔1〕。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)具有非常重功能的細(xì)胞器，它是細(xì)胞進(jìn)行呼吸、氧化磷酸化，產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所。MMP是評(píng)價(jià)線粒體功能的重要指標(biāo)之一。MMP的功能正常與否直接影響線粒體進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷，因此MMP是維持線粒體功能正常所必需的重要條件之一。有研究表明，在許多缺氧、缺血性疾病的病理生理變化過(guò)程中，MMP會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致線粒體腫脹，細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活一些蛋白質(zhì)系統(tǒng)，引起細(xì)胞凋亡。因此，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的早期重要表現(xiàn)之一就是MMP的下降〔2〕。

GHSR存在于人體多個(gè)器官組織，例如下丘腦、腎上腺、胃腸道等均有表達(dá)，在動(dòng)靜脈血管中也有表達(dá)。研究表明，Ghrelin具有生長(zhǎng)激素/胰島素樣生長(zhǎng)因子依賴(lài)和非依賴(lài)的心血管保護(hù)作用。特別是可以改善血管內(nèi)皮功能，包括抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、增加內(nèi)皮型NO合酶表達(dá)、促進(jìn)血管再生及抑制炎癥反應(yīng)等。研究表明，外源性Ghrelin可以抑制大鼠肺ET-1過(guò)表達(dá)，降低肺動(dòng)脈壓力〔4～7〕。本研究提示Ghrelin能夠維持由缺氧引起的細(xì)胞因子水平變化，保護(hù)缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能改變，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受，對(duì)缺氧引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

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