王英+羅浩虹+高洪泉+繆智輝+趙亞清

【摘要】目的研究人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能及其移植后對(duì)糖尿病大鼠的治療效果。方法體外分離培養(yǎng)HUCB-MSCs, 在胰島細(xì)胞培養(yǎng)條件下經(jīng)藥物定向誘導(dǎo)其分化；免疫組化對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行胰島β細(xì)胞標(biāo)記鑒定；雙硫腙染色鑒定鋅離子表達(dá)及檢測(cè)胰島樣細(xì)胞的移植效果。結(jié)果HUCB-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后, 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示表達(dá)人胰島素；雙硫腙染色呈棕紅色；移植后2周, 胰島樣細(xì)胞組血糖濃度明顯降低。結(jié)論HUCB-MSCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下, 具有向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能, 這種細(xì)胞可能為Ⅰ型糖尿病提供一條新的治療途徑。

【關(guān)鍵詞】人臍帶血；間充質(zhì)干細(xì)胞；定向誘導(dǎo)；糖尿病

Inducing human umbilical cord blood mesenchymal stem cells into insulin secreting cells in vitro culture and its effects on diabetes rats WANG Ying, LUO Hao-hong, GAO Hong-quan, et al. Medical College of Xiamen, Xiamen 361008, China

【Abstract】ObjectiveTo explore the possibility of inducing the differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells(HUCB-MSCs) into insulin secreting cells in vitro and the therapeutic efficacy on diabetic rats following transplantation. Methods?We isolated and cultured HUCB-MSCs, and induced HUCB-MSCs to differentiate into insulin secreting cells in the islet cell culture condition. HUCB-MSCs of induction were detected by immunocytochemical Methods. Zinchydronium was detected by Dithizon staining. Transplantation efficiency of islet-like cells was detected. Results?Under induction, immunocytochemical examination showed that the expression of human insulin was positive. Dithizon stain showed that the cytoplasm of HUCB-MSCs was stained in brownish red color after induction. At 2 weeks following transplantation, blood glucose concentration in the islet-like cell group significantly reduced. Conclusion?HUCB-MSCs can be differentiated into insulin secreting cells in vitro. HUCB-MSCs have the potential to become an excellent candidate in β cell replacement therapy of typeⅠdiabetes.

【Key words】Human umbilical cord blood; Mesenchymal stem cells; Induction; Diabetes rats2000年, Erices等［1］報(bào)道人臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell/ mesenchymal progenitor cell, MSC/MPC)。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells, UCB-MSCs)為中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞, 具有多向分化的潛在能力, 其形態(tài)和生物學(xué)特點(diǎn)與骨髓來源 MSCs 相似［2］。UCB-MSCs具備自我更新和增殖的能力, 并具備多向分化潛能特性。在一定條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化后具有向神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞等方向分化功能, 可作為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞和基因治療的載體細(xì)胞［3-5］。臍血又具有淋巴細(xì)胞抗原性弱、功能相對(duì)不成熟、移植后發(fā)生移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)較低等特點(diǎn), 與其他類型的干細(xì)胞比較, 取材方便, 擴(kuò)增數(shù)大, 來源廣泛, 不受倫理和道德的限制, 因此臍血干細(xì)胞將以其自身的特性和優(yōu)勢(shì)占據(jù)重要的位置, 具有重大的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［6］。

1試劑與方法

1. 1試劑DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(杭州四季青公司)；重組堿性成纖維生長因子(basic fibroblastgrowth factors, bFGF)、重組表皮生長因子(epidermisgrowth factors, EGF)、β-細(xì)胞調(diào)節(jié)素(PeproTech公司)；β-巰基乙醇(上海試劑四廠)；尼克酰胺、ITS、雙硫腙、B27(GBICO公司)；熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體CD49d、CD34(Bioscience美國)；小鼠抗人胰島素單克隆抗體 (Neomarkers公司)。

1. 2HUCB-MSCs表面標(biāo)記檢測(cè)取第4代的HUCB-MSCs, 經(jīng)消化后離心, 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml, 接種有蓋玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng), 當(dāng)細(xì)胞生長到融合狀態(tài)時(shí), 取出蓋玻片, 再按照試劑盒說明進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色, 實(shí)驗(yàn)組分別滴加50 μl一抗小鼠抗人抗體CD49d、CD34于蓋玻片上, 然后按照常規(guī)細(xì)胞化學(xué)染色方法進(jìn)行操作?？瞻讓?duì)照組用PBS代替一抗。倒置顯微鏡下觀察拍照。

1. 3體外誘導(dǎo)后胰島細(xì)胞檢測(cè)

1. 3. 1雙硫腙的染色誘導(dǎo)方法參考［7］。6孔培養(yǎng)板中將誘導(dǎo)約12 d及未誘導(dǎo)的細(xì)胞, PBS洗2遍, 然后每個(gè)孔分別加入1 ml PBS和10 μl雙硫腙儲(chǔ)存液, 充分混勻, 置37℃孵育20 min后, PBS洗3次, 倒置顯微鏡觀察并拍照。

1. 3. 2免疫細(xì)胞化學(xué)染色將誘導(dǎo)12 d的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色, 用小鼠抗人胰島素單克隆抗體作為一抗, 參照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作, DAB染色、脫水、透明、封片, 光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。對(duì)照組用PBS代替一抗。采用圖像分析儀進(jìn)行結(jié)果分析。選取10個(gè)高倍鏡的視野計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)以及陽性細(xì)胞數(shù), 計(jì)算誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率＝陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

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1. 3. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件處理數(shù)據(jù), 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)來表示, 進(jìn)行t檢驗(yàn), P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1. 4胰島樣細(xì)胞移植造模糖尿病大鼠

1. 4. 1大鼠糖尿病模型的制備［8］將12只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組8只和對(duì)照組4只。實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹12 h后, 經(jīng)腹腔注射70 mg/kg鏈脲佐菌素(以0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解), 對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水。兩組大鼠注射后2 d, 4 d, 6 d從尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖, 選連續(xù)3次血糖濃度高于16.7 mmol/L(正常值為2.80~7.56 mmol/L)的大鼠作為糖尿病模型。

1. 4. 2胰島樣細(xì)胞團(tuán)的移植8只實(shí)驗(yàn)組分為4只胰島樣細(xì)胞組, 4只模型對(duì)照組。取2×106個(gè)的第4~8代HUCB-MSCs用900 μl PBS重懸細(xì)胞, 吸入1 ml注射器內(nèi)經(jīng)尾靜脈注入糖尿病鼠體內(nèi)。模型對(duì)照組注入等體積的生理鹽水。各組大鼠均于移植前及移植后2 d檢測(cè)空腹血糖濃度, 以后每周定點(diǎn)檢測(cè)空腹血糖1次。

2結(jié)果

2. 1貼壁細(xì)胞鑒定對(duì)第4代貼壁細(xì)胞通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色, 結(jié)果顯示貼壁的細(xì)胞CD49d表達(dá)陽性, 細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色(見圖1)；而CD34表達(dá)陰性, 大部分細(xì)胞質(zhì)未著色, 細(xì)胞核為藍(lán)色(見圖2)。說明貼壁細(xì)胞為HUCB-MSCs。

2. 2誘導(dǎo)胰島細(xì)胞的檢測(cè)

2. 2. 1胰島細(xì)胞雙硫腙(DTZ)染色結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在DTZ染色的過程中, 多數(shù)細(xì)胞由貼壁狀態(tài)變成懸浮細(xì)胞, 只有少數(shù)細(xì)胞保持貼壁狀態(tài)。DTZ是鉛試劑, 與胰島β細(xì)胞內(nèi)豐富的鋅離子結(jié)合染成了棕紅色。在倒置顯微鏡下觀察, 經(jīng)DTZ染色顯示多數(shù)細(xì)胞為棕紅色(見圖3)。對(duì)照組的細(xì)胞DTZ染色不著色。

2. 2. 2免疫細(xì)胞化學(xué)染色在高糖等誘導(dǎo)環(huán)境下, UCB-MSCs聚集成為細(xì)胞團(tuán), 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞可觀察到特異性的胰島素表達(dá), 陽性細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)為棕褐色(見圖4)。說明細(xì)胞質(zhì)中有胰島素分泌, 細(xì)胞核淡黃色。對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)染色呈陰性, 不含胰島素。實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組的誘導(dǎo)分化陽性率及灰度值見表1, 表2, 圖5, 圖6。

表112 d兔抗人胰島素抗體檢測(cè)結(jié)果( x-±s, ％)

組別 n 誘導(dǎo)率

實(shí)驗(yàn)組 8 23.75±3.59a

對(duì)照組 4 1.52±0.89

注：兩組比較, a P<0.05

圖512 d誘導(dǎo)細(xì)胞兔抗人胰島素抗體表達(dá)柱形圖

表212 d圖像分析系統(tǒng)灰度值測(cè)定結(jié)果( x-±s)

(背景染色：183.3674±3.2865)

組別 兔抗人胰島素抗體

實(shí)驗(yàn)組 112.68±5.41a

對(duì)照組 184.14±1.24

注：兩組比較, a P<0.05

圖612 d兔抗人胰島素抗體免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果灰度值比較

2. 3胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植效果檢測(cè)血糖濃度正常的大鼠經(jīng)腹腔注射鏈脲菌素2 d后, 大鼠血糖的濃度迅速升高；4 d、6 d后大鼠血糖濃度均高于16.7 mmol/L。胰島樣細(xì)胞移植后2周, 胰島樣細(xì)胞組大鼠血糖濃度明顯降低, 模型對(duì)照組血糖濃度一直處于糖尿病血糖濃度范圍內(nèi)(見表3)。

表3胰島樣細(xì)胞移植后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠空腹

血糖濃度的變化( x-±s, n=3, mmol/L)

組別 n 2周 4周 6周

胰島樣細(xì)胞組 4 23.57±5.23a 18.67±4.51a 16.42±1.42

模型對(duì)照組 4 25.36±3.35 25.36±3.35 24.52±8.72

注：aP<0.05, 組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3討論

間充質(zhì)干細(xì)胞來源于胚胎發(fā)育期的中胚層, 是間充質(zhì)細(xì)胞起源于微環(huán)境中的一類多能性前體細(xì)胞。近年來UCB-MSCs作為一種同質(zhì)細(xì)胞群, 已經(jīng)被眾多實(shí)驗(yàn)室成功分離。UCB-MSCs不僅在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可向外胚層、中胚層、內(nèi)胚層分化, 而且還有向傷處遷移的能力, 是基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)材料的理想細(xì)胞和基因治療的載體。本實(shí)驗(yàn)通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)分離培養(yǎng)的細(xì)胞表面標(biāo)記CD49d陽性表達(dá), CD34陰性表達(dá), 由此證明培養(yǎng)的細(xì)胞為HUCB-MSCs。

間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化胰島β細(xì)胞的誘導(dǎo)因素包括兩類：一類為啟動(dòng)胰島β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的生物因子, 如bFGF、肝細(xì)胞生長因子、尼克酰胺等；另一類為誘導(dǎo) nestin 蛋白的表達(dá), 如β-巰基乙醇、DMSO 等［9］。本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)方案分為三個(gè)階段, 第一、二階段HUCB-MSCs形態(tài)未見明顯變化, 細(xì)胞數(shù)量增長速度有所減慢;第三階段相鄰細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)變化, 開始逐漸變圓并聚集成胰島樣細(xì)胞團(tuán), 這些細(xì)胞團(tuán)呈類圓形, 大小不等。誘導(dǎo)后的細(xì)胞, 經(jīng)DTZ染色胰島細(xì)胞染成棕紅色, 經(jīng)胰島素免疫熒光染色檢測(cè), 呈陽性反應(yīng), 而對(duì)照組則沒有著色。說明HUCB-MSCs 經(jīng)誘導(dǎo)后得到了胰島素分泌細(xì)胞。胰島樣細(xì)胞經(jīng)糖尿病大鼠尾靜脈移植入體內(nèi)2周后, 糖尿病大鼠空腹血糖濃度明顯下降, 說明胰島樣細(xì)胞分泌的胰島素迅速發(fā)揮了降血糖的作用, 胰島樣細(xì)胞移植可以治療糖尿病。這種HUCB-MSCs移植入糖尿病大鼠體內(nèi)發(fā)揮降血糖作用的優(yōu)化條件和維持時(shí)間將成為今后研究的重點(diǎn)。

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［收稿日期：2014-03-19］

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