劉麗娟 張國(guó)強(qiáng) 溫潔新 于 亮 宣曉梅 李英濤 李艷佳

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050031)

樹(shù)突細(xì)胞(DCs)是人體內(nèi)“專職的”抗原提呈細(xì)胞(APC)，對(duì)于調(diào)控Th1及Th2細(xì)胞分化發(fā)揮重要的作用〔1，2〕。CD83和CD86是DCs表面表達(dá)的協(xié)同共刺激分子和特征性標(biāo)志分子〔3〕。維A酸是由維生素A衍生而來(lái)的化合物，可以調(diào)控多種細(xì)胞的形態(tài)，對(duì)多種細(xì)胞的增殖、凋亡及上皮細(xì)胞和其他細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化等都具有廣泛的生物學(xué)活性〔4〕；近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它還具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。阿維A是第二代維A酸類藥物，具有調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞分化和增殖的作用〔5，6〕，在皮膚科領(lǐng)域主要用于銀屑病及一些角化性疾病的治療，具有較好的療效〔7，8〕，但其作用機(jī)制與DCs的關(guān)系尚不清楚。本文擬探討阿維A對(duì)正常人外周血DCs的影響，以期尋找阿維A治療自身免疫性皮膚病的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 健康獻(xiàn)血成人20例，男12例，女8例，年齡20～48歲，平均34歲，抽血前至少2個(gè)月內(nèi)均未系統(tǒng)應(yīng)用過(guò)皮質(zhì)類固醇及免疫抑制劑。抽血前均簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑 Epics-XL Ⅱ型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司；阿維A，重慶華邦有限公司惠贈(zèng)；鼠抗人CD83-FITC單克隆抗體(HB15a)、鼠抗人CD86-PE單克隆抗體(HA5.2B7)，美國(guó)Beckman Coulter公司；IL-12 ELISA試劑盒，上海西唐生物科技有限公司。重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重組人白介素-4(rhIL-4)，PEPROTECH Asia公司。

1.3人外周血DCs的制備 取健康成人外周靜脈血30 ml(肝素抗凝)，使用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)方法分離制備外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。生理鹽水洗滌細(xì)胞3次。用含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109個(gè)/L，加入到6孔培養(yǎng)板中(3 ml/孔)，放入37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)溫的RPMI1640培養(yǎng)液輕輕洗去未貼壁的細(xì)胞，所獲得的貼壁細(xì)胞即為擬誘導(dǎo)DCs的單核細(xì)胞。向6孔板中每孔貼壁細(xì)胞中加入含有15%胎牛血清、50 μg/L rhIL-4和rhGM-CSF細(xì)胞因子的RPMI1640培養(yǎng)液3 ml，放入37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日半量換液(吸出30%，加入60%)。同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的細(xì)胞因子。每次換液吸出的培養(yǎng)液均用離心機(jī)離心保留培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞。培養(yǎng)6 d后收集懸浮的細(xì)胞，即誘導(dǎo)的DCs。

1.4阿維A藥物干預(yù) 當(dāng)DCs培養(yǎng)的第7天，向培養(yǎng)液中加入不同濃度的阿維A，使其藥物濃度分別達(dá)到1 nmol/L和10 nmol/L，對(duì)照組只加培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的rhIL-4和rhGM-CSF細(xì)胞因子，繼續(xù)置于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加藥后培養(yǎng)12 h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.5FCM檢測(cè)DCs表型 將收集的DCs用生理鹽水洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010個(gè)/L，每例標(biāo)本取細(xì)胞懸液0.6 ml 分別放入4個(gè)試管(0.1 ml/管)，分別加入CD83、CD86及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體?；靹蚝?，室溫避光放置30 min，生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，加入1 ml生理鹽水，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)DCs分泌IL-12細(xì)胞因子含量 將實(shí)驗(yàn)中收集到的細(xì)胞培養(yǎng)液，利用常規(guī)的ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)IL-12表達(dá)量，具體操作步驟按照IL-12 ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1FCM檢測(cè)DCs中CD83、CD86表達(dá)水平 體外成功培養(yǎng)出DCs(圖1)。1 nmol/L和10 nmol/L阿維A作用DCs 12 h后，健康成人外周血DCs中CD83表達(dá)率分別為(56.65±7.09)%、(63.82±5.81)%，顯著高于陰性對(duì)照組〔(43.55±4.32)%〕(P<0.05)；CD86表達(dá)率分別為(65.43±1.79)%、(73.73±2.10)%顯著高于陰性對(duì)照組〔(52.96±1.10)%〕(P<0.05)。

2.2ELISA檢測(cè)DCs分泌IL-12細(xì)胞因子含量 1 nmol/L和10 nmol/L阿維A作用DCs 12 h后，健康成人外周血DCs分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-12表達(dá)水平分別為(51.377±4.527)、(60.659±4.973) pg/ml，顯著高于對(duì)照組〔(39.927±2.809) pg/ml〕(P<0.05)，且10 nmol/L組較1 nmol/L阿維A組顯著提高(P<0.05)。

阿維A作用前

1 nmol/L阿維A

10 nmol/L阿維A

3 討 論

免疫系統(tǒng)能否維持人體正常的免疫功能在機(jī)體生理功能衡定方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。免疫反應(yīng)的起始首先由APC經(jīng)過(guò)攝取、加工及處理抗原后，將信息傳遞給T、B細(xì)胞，從而引發(fā)一系列的免疫應(yīng)答。DCs是體內(nèi)“專職的”APC，也是激發(fā)初次免疫應(yīng)答的APC，是機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者〔9〕。DCs按成熟狀態(tài)的不同可分為未成熟的DCs(imDCs )和成熟的DCs(mDCs)。CD83被認(rèn)為是mDCs的特征性表面標(biāo)記分子，有很強(qiáng)的激活淋巴細(xì)胞的功能，是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答必不可少的調(diào)節(jié)性分子〔3〕。CD86是T細(xì)胞活化所必需的信號(hào)分子，缺乏CD86或表達(dá)量低可導(dǎo)致機(jī)體接觸病原微生物或有害因素刺激時(shí)不能將這些抗原信息有效地傳遞給T細(xì)胞，不能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)本身有害的物質(zhì)清除。IL-12是Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以促使Th0向Th1細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。有資料表明，只有DCs成熟時(shí)才可以大量分泌IL-12〔10〕，因此IL-12的水平又是衡量DCs是否向成熟方向分化的一個(gè)指標(biāo)。阿維A具有調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞分化和增殖的作用。目前阿維A作用于DCs的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度阿維A 作用DCs 相同時(shí)間后，CD83、CD86表達(dá)顯著增加，且隨阿維A濃度的增加而增強(qiáng)，即具有阿維A濃度依賴性。由此推測(cè)阿維A可促進(jìn)DCs表面標(biāo)記的表達(dá)并在一定時(shí)間上表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。CD83、CD86的表達(dá)明顯上調(diào)表明阿維A可以促使DCs向成熟方向分化，增加了DCs激活T淋巴細(xì)胞的輔助刺激信號(hào)功能，增強(qiáng)了DCs的抗原提呈能力，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。同時(shí)，不同濃度阿維A 作用DCs 相同時(shí)間后，IL-12分泌量顯著增加，同樣具有阿維A濃度依賴性。由此推測(cè)阿維A對(duì)DCs分泌IL-12有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，誘導(dǎo)Th0向Th1細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；同時(shí)也可影響DCs的分化，促進(jìn)DCs向成熟方向分化，這與FCM檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記的結(jié)果一致。

綜上，阿維A可影響DCs的成熟度，促進(jìn)DCs向成熟方向分化，從而提高DCs的抗原提呈能力，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答而非誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)。其機(jī)制可能與阿維A上調(diào)細(xì)胞表面標(biāo)記CD83、CD86的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞因子IL-12的分泌有關(guān)，這為臨床治療自身免疫性皮膚病提供了新的理論依據(jù)。

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