劉 珊 張明霞 劉倫志

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 恩施 445000)

本研究采用一次性尾靜脈注射阿霉素(ADR)的方法制備大鼠的微小病變性腎病(MCD)模型，并測(cè)定血清和腎組織中輔助性T淋巴細(xì)胞(Th1)相關(guān)的白細(xì)胞介素(IL-18)和γ-干擾素(IFN-γ)水平，旨在初步探討ADR制備的MCD大鼠Th1相關(guān)的IL-18和IFN-γ表達(dá)及意義，為臨床預(yù)防和治療MCD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠，體重200～220 g，隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)和模型組(30只)。

1.1.2試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、小牛血清(美國Amresco公司)、胰蛋白酶(美國Amresco公司)。大鼠IL-18和IFN-γ ELISA試劑盒(美國R&D生物公司生產(chǎn))、注射ADR溶液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H33021980)。

1.2方法

1.2.1模型制作 模型組大鼠尾靜脈內(nèi)一次性注射ADR溶液2 g/L(用生理鹽水配制)，給藥量7.5 mg/kg；對(duì)照組給予一次性尾經(jīng)脈注射等量生理鹽水。所有大鼠均飼養(yǎng)于隔離環(huán)境的代謝籠中，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料與水。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo)及方法 (1)細(xì)胞因子測(cè)定：實(shí)驗(yàn)第7、14、28、42天將各組大鼠在乙醚淺麻醉下自眼眶靜脈叢采血，先按壓大鼠頸部?jī)蓚?cè)，讓眼眶靜脈叢充分充血，摘眼球采血5 ml，室溫靜置15 min，4℃ 3 000 r/min 離心15 min，分離血清。剖腹取腎，將右側(cè)腎組織勻漿后離心，取上清液3 ml，均置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，采用ELISA法測(cè)定IL-18和IFN-γ的水平，具體方法參見R&D公司產(chǎn)品說明書。(2)24 h尿蛋白檢測(cè)：分別在ADR注射后6、13、27、41 d將兩組大鼠單獨(dú)喂養(yǎng)在代謝籠中，自由飲水，收集24 h尿液，尿標(biāo)本離心后取上清，記錄24 h尿量；采用鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合法(日立7170A型全自動(dòng)生化分析儀)檢測(cè)24 h尿蛋白定量。(3)血生化檢測(cè)：于實(shí)驗(yàn)第42天乙醚麻醉大鼠，處死前摘眼球采血3 ml，血標(biāo)本離心后取上清，用Beckman Coulter DXC-800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠24 h尿蛋白變化 模型組30只大鼠在造模后尿蛋白均達(dá)到>30 mg/24 h以上，表明造模成功。模型組大鼠在第7天出現(xiàn)蛋白尿，隨著時(shí)間的推移，蛋白尿的量持續(xù)升高，在第42天達(dá)到峰值，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠的蛋白尿水平均明顯高于同時(shí)間的對(duì)照組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠24 h尿蛋白變化±s，mg/24 h)

2.2兩組大鼠血清TC、TG、ALB、TP、BUN、Scr水平比較 第42天模型組血清TC、TG水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；而ALB、TP明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。兩組大鼠血清BUN和Scr比較無明顯差異(P>0.05)。見表2。

2.3兩組大鼠血清及腎組織IL-18和IFN-γ水平比較 模型組大鼠7、14、28、42 d的血清及腎組織IL-18和IFN-γ水平均明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)。見表3，表4。

表2 兩組大鼠血清TC、TG、ALB、TP、BUN、Scr水平比較±s)

表3 兩組大鼠血清及腎組織IL-18水平比較±s，pg/ml)

表4 兩組大鼠血清及腎組織IFN-γ水平比較±s，pg/ml)

3 討 論

ADR是臨床上常用的一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，制造ADR大鼠腎病模型利用的是ADR的腎毒性〔1〕。據(jù)報(bào)道〔11〕，Sprague Dawley(SD)、Wistar大鼠與BALB/c小鼠具有對(duì)ADR敏感、模型特征出現(xiàn)迅速、持續(xù)和穩(wěn)定的特點(diǎn)，是被公認(rèn)的能較好模擬人類腎小球疾病的動(dòng)物模型，被廣泛應(yīng)用于腎臟病研究領(lǐng)域〔3〕。

微小病變型腎病綜合征(MCNS)是兒童原發(fā)腎病綜合征中最常見的疾病，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，原發(fā)性病因未明〔4〕。近些年來，相關(guān)文獻(xiàn)〔5〕報(bào)道Th淋巴細(xì)胞亞群功能失衡與MCNS的關(guān)系密切。IL-18對(duì)天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)都有著重要的調(diào)節(jié)作用〔6〕。本研究結(jié)果表明ADR腎病大鼠的血清及腎組織IL-18、IFN-γ水平與正常對(duì)照組大鼠相比明顯升高。這主要是由于IL-18是一種強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)因子，對(duì)多種細(xì)胞尤其免疫細(xì)胞有多向性作用，在慢性炎癥、自身免疫性疾病、多種癌瘤以及多種傳染病的感染部位都有IL-18表達(dá)；另外，IL-18還可以顯著刺激Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。

綜上，IL-18及以Th1型為主的免疫失衡在MCD發(fā)病中起重要作用，可通過抑制或中和內(nèi)源性IL-18和IFN-γ的表達(dá)糾正失衡的Thl/Th2，此方法有可能成為MCD治療的新途徑。

4 參考文獻(xiàn)

1馬曉紅，何立群.不同劑量阿霉素致大鼠局灶節(jié)段硬化腎病模型的建立比較〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013；23(1)：37-42.

2王軍建，李少寧，林 菲，等.霉酚酸酯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎小球Nephrin和TGF-β1表達(dá)的影響〔J〕.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013；42(1)：13-7.

3王軍建，胡 銳.丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素腎病大鼠腎小球nephrin和TGF-β1的表達(dá)影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011；17(19)：245-51.

4龍吉美，黃德彬，李魁武，等.鉤藤堿對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎損傷的作用及其機(jī)制〔J〕.中國病理生理雜志，2012；28(10)：1887-91.

5賀德剛，張春江，歐海青，等.ILK在微小病變型腎病大鼠模型中意義的研究〔J〕.山東醫(yī)藥，2010；50(16)：42-5.

6王晨丹，李榮山，王 晨，等.根據(jù)細(xì)胞周期序貫應(yīng)用免疫抑制劑治療大鼠阿霉素腎病〔J〕.中華腎臟病雜志，2012；28(3)：232-8.