楊 潔 李 杰 李 燕 袁 軍 王瑞倉(cāng) 王素云 王 超 郝洪嶺

(河北省人民醫(yī)院血液科，河北 石家莊 050051)

早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是急性髓細(xì)胞白血病的一個(gè)亞型，約90%的APL伴有t(15;17)(q22;q21)，形成PML/RARα融合基因。APL是預(yù)后最好的急性髓細(xì)胞白血病，但病情兇險(xiǎn)，誘導(dǎo)緩解過(guò)程中死亡率高，由于老年人常合并多種疾病，對(duì)化療等治療的耐受性差，故治療上困難較大。全反式維甲酸(ATRA)和亞砷酸(As2O3)治療APL已獲得肯定療效，尤其上述藥物與化療藥物相比不良反應(yīng)小,適合于臨床上難以耐受強(qiáng)烈化療的老年患者。黏附分子CD44是一種廣泛分布的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，可通過(guò)選擇性表達(dá)不同的外顯子形成多種同源異構(gòu)體，即CD44s與CD44v。CD44高表達(dá)于所有AML亞型原始細(xì)胞上，其在急性白血病細(xì)胞上的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，CD44v6可以作為AML的不良預(yù)后因子〔1〕。本文應(yīng)用ATRA和As2O3作用于NB4細(xì)胞，觀察不同CD44v分子和PML/RARα表達(dá)的變化及相互關(guān)系，探討CD44v在急性白血病等血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中的重要作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株及培養(yǎng) 人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院惠贈(zèng)。NB4細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每1～2 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2主要試劑 RPMI-1640、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。ATRA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用前2 w以無(wú)水乙醇配成濃度為1 μmol/L的儲(chǔ)存液，-20℃避光保存，用時(shí)終濃度為1 μmol/L。As2O3購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司，用前以磷酸鹽緩沖液(PBS液)配成濃度為1 mmol/L的儲(chǔ)存液，4 ℃避光保存，用時(shí)終濃度為1 umol/L。鼠抗人CD11b-FITC及同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。AnnexinV-FITC/PI試劑盒購(gòu)自北京創(chuàng)根勝泰科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組 ①空白對(duì)照組；②ATRA組：1 μmol/L ATRA；③As2O3組： 1 μmol/L As2O3；④ATRA+As2O3組：1 μmol/L ATRA+1 μmol/L As2O3。

1.3.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，按上述實(shí)驗(yàn)分組分別加入100 μl的藥物，培養(yǎng)24、48、72、96 h后分別取出，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入三聯(lián)液100 μl(10%SDS-5%異丁醇-0.012 mmol/L HCl)，均勻震蕩30 min左右，37℃過(guò)夜，顯微鏡下觀察著色顆粒消失后，以560 nm為測(cè)試波長(zhǎng)，讀取吸光度A值。根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=〔對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值〕/對(duì)照組A值×100%。

1.3.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b抗原表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入上述藥物，分別培養(yǎng)48、72、96 h，收集各組細(xì)胞于流式細(xì)胞儀專用管中，每管加4～5 ml PBS液洗滌細(xì)胞2次，加單克隆抗體(CD11b-FITC)20 μl，4 ℃避光孵育15～30 min后，再用PBS洗滌1次，棄去上清，加入0.5 ml PBS液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用AnnexinV-FITC/PI法。收集不同藥物處理24、48、72、96 h的NB4細(xì)胞，以PBS緩沖液清洗2次，棄上清，將細(xì)胞重懸于200 μl上樣緩沖液中，加入10 μl AnnexinV-FITC和10 μl PI，混勻，室溫，避光反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.5逆轉(zhuǎn)錄熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RQ-PCR)法檢測(cè)細(xì)胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA表達(dá) 收集空白對(duì)照組、經(jīng)ATRA、As2O3及ATRA+As2O3處理48、72、96 h后的NB4細(xì)胞，分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，用PCR儀擴(kuò)增目的基因，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，由ABI 7300 Real-time PCR System完成。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比(對(duì)照組RQ值為1.0)，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。引物由上海生物工程公司合成，引物序列：PML/RARα上游引物：5＇-AGTGTACGCCTTCTCCATCA-3＇，下游引物：5＇-CAGAACTG CTGCTCTGGGTCTCAAT-3＇，CD44v3上游引物：5＇-TTTCAACCACACC ACGGGC-3＇，下游引物：5＇- CACTTCCGGATTTGAATGGCT-3＇，CD44v6上游引物：5＇-GGCAACTCCTAGTAGTACAACG-3＇，下游引物：5＇- AGCTGTCCCTGTTGTCGAAT-3＇，CD44v10上游引物：5＇- GGTGGAAG AAGAGACCCAAATC-3＇，下游引物：5＇-CCAAGATGATCAGCCATTC TGG -3＇，β-actin上游引物：5＇-TGGCACCCAGCACAATGAA-3＇，下游引物：5＇-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGC A-3＇。

2 結(jié) 果

2.1ATRA、As2O3對(duì)NB4細(xì)胞的增殖抑制作用 藥物作用于NB4細(xì)胞24、48、72、96 h后，ATRA組生長(zhǎng)抑制率由(1.75±1.47)%升至(14.5±4.84)%；As2O3組由(3.31±1.02)%升至(20.59±3.88)%；ATRA+As2O3組由(2.56±1.43)%升至(32.45±2.07)%；上述各組對(duì)NB4細(xì)胞均有增殖抑制作用，隨時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制率明顯增加；同一時(shí)間點(diǎn)，24 h各處理組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，生長(zhǎng)抑制率As2O3+ATRA組大于其他各組。

2.2ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對(duì)NB4細(xì)胞表面CD11b抗原表達(dá)的影響 作用于NB4細(xì)胞48 h、72 h、96 h后CD11b抗原表達(dá)ATRA組為(32.47±2.95)%、(84.93±1.45)%、(90.9±0.35)%；AS2O3組(10.96±1.33)%、(15.70±0.87)%、(18.90±0.30)%；ATRA+AS2O3組：(18.56±0.65)%、(21.16±0.65)%、(26.53±0.83)%。各個(gè)處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)CD11b表達(dá)逐漸增多，各時(shí)間點(diǎn)之間有顯著性差異(P<0.05)；同一時(shí)間點(diǎn)，各處理組間比較，CD11b的表達(dá)ATRA組高于 ATRA+As2O3組，高于As2O3組。

2.3As2O3、ATRA+As2O3對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的影響 作用于NB4細(xì)胞24、48、72、96 h后，As2O3組早期凋亡率為(9.53±0.59)%、(13.77±0.70)%、(18.27±0.35)%、(16.23±1.15)%；24、48、72 h As2O3組NB4細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)，中晚期凋亡率〔(3.20±0.43)%、(21.63±0.87)%、(49.33±1.09)%〕及總凋亡率〔(12.73±0.44)%、(35.40±0.30)%、(67.60±1.20)%〕均明顯增高，呈時(shí)間依賴性。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)As2O3組凋亡率均高于其他各組(P<0.05)。

2.4ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對(duì)NB4細(xì)胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10mRNA表達(dá)水平的影響 以各組各指標(biāo)空白對(duì)照RQ值為1，作用于NB4細(xì)胞48 h、72 h、96 h后，ATRA+As2O3組PML/RARα及CD44v6的RQ值均逐漸降低；各處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)上述各指標(biāo)的表達(dá)均呈遞減趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)，不同處理組間，除72 h ATRA組和ATRA+As2O3組CD44v10的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)外，其他各組PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表達(dá)經(jīng)ATRA+As2O3作用后下降最明顯(P<0.05)。經(jīng)繪制散點(diǎn)圖并應(yīng)用直線相關(guān)分析得出：經(jīng)ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用前后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，PML/RARα與CD44v6的變化趨勢(shì)均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.98(P<0.01)、r=0.951(P<0.01)、r=0.999(P<0.01)；As2O3作用前后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，PML/RARα與CD44v3的變化趨勢(shì)呈正相關(guān)，(r=0.965，P<0.01)，其他各組之間無(wú)直線相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)表1、2。

表1 ATRA,As2O3,ATRA+As2O3作用于 NB4細(xì)胞PML/RARα RQ值±s)

表2 ATRA,As2O3,ATRA+As2O3作用于 NB4細(xì)胞CD44v6 RQ值±s)

3 討 論

ATRA和As2O3治療APL的療效已得到國(guó)內(nèi)外公認(rèn)，二者都具有降解PML-RARα蛋白的能力，ATRA作用于RARα部分，而As2O3作用于PML部分，二者聯(lián)合具有協(xié)同作用。已有報(bào)道，運(yùn)用RQ-PCR觀察到聯(lián)用組比單用組對(duì)PML-RARα的轉(zhuǎn)錄抑制作用明顯〔2〕。As2O3對(duì)APL細(xì)胞發(fā)揮劑量依賴的雙重效果，即相對(duì)高的濃度(0.5～2.0 μmol/L)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，相對(duì)低的濃度(0.1～0.5 μmol/L)誘導(dǎo)部分細(xì)胞分化。

CD44黏附分子在造血細(xì)胞生成、白血病的病程進(jìn)展及治療、預(yù)后中的作用日益受到重視，特別是CD44v可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)過(guò)程。Yokota等〔3〕發(fā)現(xiàn)，急性白血病患者血清CD44水平是正常對(duì)照組平均水平的4倍，且與疾病狀態(tài)相關(guān)?；熀笱錍D44水平持續(xù)高于500 ng/ml的患者易復(fù)發(fā)。CD44v，特別是CD44v6的高表達(dá)與急性淋巴細(xì)胞白血病不良臨床預(yù)后相關(guān)。他們認(rèn)為血清CD44或可成為急性白血病患者疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)指標(biāo)。Sansonetti等〔4〕的研究表明，激活CD44可以增強(qiáng)AML5的細(xì)胞存活，阻止其凋亡，在這一過(guò)程中Mcl-1抗凋亡蛋白發(fā)揮了重要作用。

本研究結(jié)果提示藥聯(lián)合對(duì)NB4細(xì)胞的增殖抑制最顯著，也說(shuō)明兩藥聯(lián)合對(duì)APL療效最好。上述結(jié)果與Shen等〔2〕報(bào)道的應(yīng)用RQ-PCR證實(shí)ATRA與As2O3聯(lián)用組比單用組在PML/RARα的轉(zhuǎn)錄上有明顯的抑制作用的結(jié)論相一致。王秦等〔5〕研究ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化過(guò)程中黏附分子CD44的變化，發(fā)現(xiàn)ATRA作用NB4細(xì)胞后，CD44表達(dá)減弱，降低了APL細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，這與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論相一致，而本實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步研究了CD44變異體的變化。Legras等〔6〕研究表明，AML患者的骨髓和外周血中CD44v6表達(dá)明顯高于CD44v3和CD44v9，AML患者CD44v6的高表達(dá)預(yù)示著常規(guī)化療后患者的生存期較短，提出CD44v6可作為AML新的預(yù)后指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述Legras等的研究結(jié)果有相似之處，而本研究是以APL這一特殊類型白血病為研究對(duì)象，并發(fā)現(xiàn)CD44v6、CD44v3與PML/RARα的變化趨勢(shì)有密切的相關(guān)性，說(shuō)明其有可能成為APL療效觀察和預(yù)后判斷的又一有用指標(biāo)。

存在直線相關(guān)關(guān)系的兩個(gè)指標(biāo)間不一定存在因果關(guān)系。就本實(shí)驗(yàn)而言，結(jié)果尚不能說(shuō)明CD44v6、CD44v3與PML/RARα之間存在因果關(guān)系，而導(dǎo)致其變化一致的原因及內(nèi)在機(jī)制不詳。劉佳寧等〔7〕用ATRA或六亞甲基二乙酰胺(HMBA)對(duì)HL60細(xì)胞誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)CD44的表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)RT-PCR等方法同時(shí)檢測(cè)cyclin E、p21和p27 mRNA，提出ATRA和HMBA在HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化中起重要作用，并通過(guò)下調(diào)CD44、及cyclin E和上調(diào)p21、p27 mRNA來(lái)介導(dǎo)該誘導(dǎo)分化過(guò)程。劉佳寧等〔8〕報(bào)道了小劑量高三尖杉酯堿(HHT)可能通過(guò)下調(diào)CD44基因表達(dá)，進(jìn)而提高p21和p27表達(dá)，抑制cyclin E活性而對(duì)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)分化作用。常國(guó)強(qiáng)等〔9〕報(bào)道CD44單克隆抗體A3D8可通過(guò)降低磷酸化ERK-1/2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Bim,從而誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的增殖抑制和早期凋亡。Gadhoum等〔10〕以A3D8單克隆抗體結(jié)合CD44，首次證實(shí)了封閉NB4細(xì)胞CD44可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物CDK p27kip1的降解而上調(diào)其水平，使p27kip1與cyclinE/Cdk2復(fù)合物的結(jié)合更加密切，從而抑制其激酶活性，提示CD44對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用必須有p27的參與。宋清曉等〔11〕報(bào)道CD44抗體HI44a通過(guò)上調(diào)GM-CSFRα、TGFβ1及下調(diào)OPN mRNA表達(dá)水平，減少OPN的分泌，抑制HL-60細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。

細(xì)胞黏附分子是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，靶向治療更是今后惡性血液病的治療趨勢(shì)，對(duì)體質(zhì)差、化療耐受力低的老年人來(lái)說(shuō)是最適合的治療方法。CD44尤其是CD44v已證實(shí)和各種白血病亞型密切相關(guān)。ATRA、As2O3對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和促凋亡作用與CD44v的關(guān)系，有哪些基因參與、所涉及的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等尚需深入研究。

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