申華峰 耿嘉男 李景賀 徐麗麗

(浙江省新昌縣人民醫(yī)院病理科，浙江 新昌 312500)

肺癌的預(yù)防與診治始終是臨床一大難題，最新調(diào)查顯示我國肺癌的發(fā)病率、死亡率已位于八大腫瘤之首，可能與吸煙、人口老齡化以及工業(yè)化導(dǎo)致的環(huán)境惡化等多種原因有關(guān)〔1〕。Clusterin 最早發(fā)現(xiàn)于公羊睪丸液，主要作用為促進(jìn)細(xì)胞聚集，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明Clusterin參與調(diào)控多種生理過程的細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡抵抗是導(dǎo)致癌癥發(fā)生、發(fā)展甚至死亡的主要原因之一。將Clusterin作為膀胱癌〔2〕和腎癌〔3〕等疾病的治療及預(yù)后的分子標(biāo)志物已有報(bào)道，而關(guān)于肺癌與Clusterin的研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬觀察不同類型肺癌組織Clusterin的表達(dá)及其與病理類型、分化程度和轉(zhuǎn)移等因素的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 選擇2011年1月至2012年12月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院住院治療的患者。其中肺鱗癌16例，年齡43～78〔平均(61±10)〕歲；肺腺癌22例，年齡42～73〔平均(58±8)〕歲；小細(xì)胞癌10例，年齡44～69〔平均(56±9)〕歲，另取10例正常肺組織標(biāo)本作為對照。所有患者在取材前均未經(jīng)任何治療，均經(jīng)病理診斷證實(shí)。

1.2主要試劑 鼠抗人Clusterin單克隆抗體(購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司)，通用型二步法免疫組化試劑盒(PV-6000)，DAB顯色劑(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法 取肺部組織固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后微波熱修復(fù)抗原；自然冷卻后3% H2O2室溫孵育20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；然后在鼠抗Clusterin單克隆抗體(1∶100稀釋) 中4℃孵育過夜；加入二抗和染色步驟嚴(yán)格按照PV-6000說明書進(jìn)行，染色時(shí)隨時(shí)在顯微鏡下觀察。PBS代替一抗作為空白對照。

1.4結(jié)果判斷 胞質(zhì)呈現(xiàn)黃色顆粒即為Clusterin蛋白陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè))，按每張切片陽性細(xì)胞所占面積百分比及著色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判斷。總分采用6分評分制：陽性細(xì)胞<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、≥51%為3分；染色強(qiáng)度無著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；據(jù)陽性細(xì)胞所占比例得分+染色強(qiáng)度得分計(jì)算總分，0分為陰性(-)、1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性()、5～6分為強(qiáng)陽性()。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，以行×列表χ2檢驗(yàn)進(jìn)行各組間Clusterin蛋白陽性表達(dá)的差異分析。

2 結(jié) 果

2.1Clusterin在不同病理類型肺癌組織中的表達(dá) Clusterin蛋白陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，正常肺組織無Clusterin表達(dá)，小細(xì)胞癌Clusterin表達(dá)率僅為10%(1/10，為+)，并且該陽性病例Clusterin主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞幾乎不表達(dá)，鱗癌中Clusterin陽性表達(dá)率為75.0%(12/16，+7例，5例)、腺癌為68.2%(15/22，+8例，7例)，小細(xì)胞癌中Clusterin的表達(dá)陽性率低(P<0.05)。而鱗癌與腺癌之間的表達(dá)無差異。

圖1 鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌肺組織中Clusterin的表達(dá)(免疫組化染色，×200)

2.2非小細(xì)胞肺癌Clusterin蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 中低分化病例表達(dá)高于高分化病例(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例高于無轉(zhuǎn)移病例(P<0.05)，非小細(xì)胞肺癌中Clusterin表達(dá)與病理類型、年齡、性別等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌Clusterin表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系(n)

3 討 論

Clusterin作為內(nèi)源性異源二聚體糖蛋白參與多種生理過程，包括機(jī)體老齡化進(jìn)程、腫瘤發(fā)生與發(fā)展、血管損傷、糖尿病、腎臟和神經(jīng)變性等，這些疾病均能導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng)、促使靶蛋白非晶質(zhì)聚集、增加基因組不穩(wěn)定性和提高細(xì)胞死亡率，有報(bào)道顯示以上過程均與Clusterin調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)氧化損傷直接相關(guān)〔4〕。Clusterin mRNA的表達(dá)主要由小干擾RNAs (siRNAs)調(diào)控，即Clusterin mRNA隨siRNAs表達(dá)增加而增加，進(jìn)而抑制人類癌癥細(xì)胞誘導(dǎo)的自發(fā)性細(xì)胞凋亡，加快細(xì)胞生長速度，降低細(xì)胞遺傳毒性和對氧化應(yīng)激的敏感性〔5〕。

研究表明Clusterin在人類很多腫瘤發(fā)生時(shí)其表達(dá)改變或參與調(diào)控癌癥細(xì)胞表達(dá)，Clusterin mRNA對前列腺腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散有較大影響〔6〕，其mRNA表達(dá)上調(diào)會抑制前列腺癌進(jìn)程，減慢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外不同組織學(xué)類型的子宮內(nèi)膜癌中Clusterin也有不同程度的表達(dá)〔7〕；結(jié)腸癌中血小板分泌血小板反應(yīng)蛋白1(TSP1)和Clusterin，二者作用于MAPK信號通路促p38MAPK磷酸化，進(jìn)而刺激基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)上調(diào)導(dǎo)致結(jié)腸癌侵襲加劇，給藥抑制p38MAPK磷酸化，則TSP1和Clusterin分泌減少，一定程度上能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞對正常細(xì)胞侵襲，達(dá)到治療目的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Clusterin與肺癌特別是非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而Panico等〔8〕利用免疫組化染色檢測早期肺腺癌中Clusterin的表達(dá)，Clusterin表達(dá)多的患者在手術(shù)治療切除腫瘤后復(fù)發(fā)率更小且生存時(shí)間更久，顯示Clusterin表達(dá)與癌癥復(fù)發(fā)率呈負(fù)相關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

1陳萬青，張思維，鄒小農(nóng).中國肺癌發(fā)病死亡的估計(jì)和流行趨勢研究〔J〕.中國肺癌雜志，2010；13(5)：488-93.

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3Sakai I，Miyake H，Takenaka A，etal.Expression of potential molecular markers in renal cell carcinoma：impact on clinicopathological outcomes in patients undergoing radical nephrectomy〔J〕.BJU Intern，2009；104(7)：942-6.

4Trougakos IP，Gonos ES.Regulation of clusterin/apolipoprotein J，a functional homologue to the small heat shock proteins，by oxidative stress in ageing and age-related diseases〔J〕.Free Radical Res，2006；40(12)：1324-34.

5Trougakos IP，So A，Jansen B，etal.Silencing expression of the clusterin/apolipoprotein j gene in human cancer cells using small interfering RNA induces spontaneous apoptosis，reduced growth ability，and cell sensitization to genotoxic and oxidative stress〔J〕.Cancer Res，2004；64(5)：1834-42.

6Blumenstein B，Saad F，Hotte S，etal.Reduction in serum clusterin is a potential therapeutic biomarker in patients with castration-resistant prostate cancer treated with custirsen〔J〕.Cancer Med，2013；2(4)：468-77.

7Ahn HJ，Bae J，Lee S，etal.Differential expression of clusterin according to histological type of endometrial carcinoma〔J〕.Gynecologic Oncol，2008；110(2)：222-9.

8Panico F，Casali C，Rossi G，etal.Prognostic role of clusterin in resected adenocarcinomas of the lung〔J〕.Lung Cancer，2012；79(3)：294-9.