張 劍 吳 敏 張自森 王利娟 張紅巧 師廣勇 巴 楠 閆 琳 鄭曉珂 邢 鑫

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，是大腸癌的最常見部分，我國(guó)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均明顯升高。SLP-2基因?qū)儆趕tomatin基因家族成員，是2001年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因〔1〕，近年來的研究顯示，SLP-2在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，可能是一個(gè)新的腫瘤相關(guān)基因〔2～6〕。本研究擬分析SLP-2蛋白的表達(dá)水平及與臨床病理資料的關(guān)系，旨在探討SLP-2在直腸癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床資料 直腸癌組織及距離癌組織邊緣>5 cm的癌旁正常直腸組織為鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2010年1月至2011年1月手術(shù)切除直腸癌標(biāo)本40例，其中男21例，女19例，年齡48～76歲，中位年齡63歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為直腸癌，術(shù)前未接受過放、化療。臨床分期按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(AJCC 2010年第7版)。

1.2RT-PCR SLP-2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度500 bp，正義5′-CTGGAGCCTGGTTTGAACAT-3′；反義5′-AGGATCTGGGCCTGTTTCTT-3′。內(nèi)參β-actin擴(kuò)增片段長(zhǎng)度242 bp，正義5′- ACACTGTGCCCATCTACGACC-3′；反義5′-AGGGGCCGGACTCGTCATAGA-3′。引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，SLP-2及內(nèi)參上、下游引物各 1 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補(bǔ)至25 μl。PCR反應(yīng)：預(yù)變性：94℃，5 min，變性94℃，30 s，退火55℃，30 s，延伸72℃，50 s，30個(gè)循環(huán)，延伸72℃，7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶圖像凝膠成像儀掃描，以SLP-2與β-actin的灰度值的比值表示SLP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3免疫組化 鼠抗人SLP-2單克隆抗體稀釋度為1∶200，購(gòu)自美國(guó)proteintech公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自邁新公司。用已知陽性片作陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)〔7〕，由兩位高年資病理醫(yī)師在雙盲條件下進(jìn)行評(píng)分，每張切片根據(jù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及陽性細(xì)胞染色程度進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)染色程度評(píng)分由每張切片的大多數(shù)細(xì)胞染色情況決定，0分：無著色，1分：淺黃色，2分：黃色，3分：棕黃色。陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分：0分：沒有陽性細(xì)胞，1分：1%～25%陽性，2分：26%～50%陽性，3分：51%～75%陽性，4分：>75%陽性。兩者分?jǐn)?shù)相乘為總分，≥8分為高表達(dá)，<8分為陰性或低表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件行χ2或t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1SLP-2 mRNA在直腸癌及癌旁正常直腸黏膜中的表達(dá) 正常直腸組織SLP-2 mRNA表達(dá)水平為0.66±0.12，直腸癌組織SLP-2 mRNA表達(dá)水平為1.35±0.27，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.076，P=0.019)，見圖1。

圖1 直腸癌(C)及癌旁正常組織(N)中SLP-2 mRNA的表達(dá)

2.2SLP-2蛋白在直腸癌及癌旁正常直腸黏膜中的表達(dá) SLP-2在直腸癌組織中多呈高表達(dá)，在癌旁正常直腸黏膜中多為陰性或低表達(dá)。SLP-2在直腸癌和癌旁正常直腸黏膜中的高表達(dá)率分別為67.5%(27/40)和22.5%(9/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 16.364，P=0.000)，見圖2。

2.3SLP-2蛋白表達(dá)與直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系 見表1。

表1 SLP-2的表達(dá)與直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

3 討 論

SLP-2基因是2000年首次發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)新基因，近年來的研究顯示，SLP-2在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，可能是一個(gè)新的惡性腫瘤相關(guān)基因。但目前有關(guān)SLP-2在直腸癌中的表達(dá)情況及對(duì)直腸癌影響的研究較少。本研究采用免疫組化法及RT-PCR法發(fā)現(xiàn)SLP-2在直腸癌組織中表達(dá)升高，并通過分析直腸癌患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)在較晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中SLP-2表達(dá)升高更為明顯。提示SLP-2可能是一個(gè)與直腸癌分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo)，在直腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起一定的促進(jìn)作用。

SLP-2是一種細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)蛋白，與細(xì)胞脂閥結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，并存在于細(xì)胞線粒體中，參與調(diào)解線粒體的能量代謝〔1，7～10〕。由于脂筏內(nèi)有多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子，可參與許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，而線粒體的能量代謝可直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等特性，因此推測(cè)，SLP-2可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路及細(xì)胞能量代謝參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Horiuchi等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)，SLP-2可能通過與Rho家族蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移。祁代華等〔12〕的實(shí)驗(yàn)顯示，結(jié)直腸癌組織中SLP-2與Rho家族的CDC42蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。Cao等〔13〕的研究發(fā)現(xiàn)，SLP-2可能通過激活MAPK / ERK信號(hào)通路促進(jìn)食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等〔7〕的研究報(bào)道，SLP-2可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)和ATP水平，影響食管癌的運(yùn)動(dòng)及增殖。Hájek等〔9〕報(bào)道，轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA下調(diào)Hela細(xì)胞的SLP-2表達(dá)后，Hela細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)降低。目前SLP-2在惡性腫瘤中的作用機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步深入探索。

本研究發(fā)現(xiàn)SLP-2在直腸癌組織中呈高表達(dá)，并與直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。惡性腫瘤的分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是決定其預(yù)后的重要因素，因此，SLP-2可能作為直腸癌的一個(gè)有意義的預(yù)后指標(biāo)，指導(dǎo)直腸癌患者的預(yù)后生存，并有可能作為一個(gè)新的腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

1Wang Y，Morrow JS.Identification and characterization of human SLP-2，a novelhomo- logue of stomatin ( band 7.2b ) present inerythrocytes and other tissues〔J〕.J Biol Chem，2000；275(117)：8062-71.

2Chang D，Ma K，Gong M，etal.SLP-2 overexpression is associated with tumor distant metastasis and poor prognosis in pulmonary squamous cell carcinoma〔J〕.Biomarkers，2010;15(1)：104-10.

3張 劍，李建生，吳 敏，等.SLP-2在胃癌組織中的表達(dá)及對(duì)胃腺癌細(xì)胞SGC7901運(yùn)動(dòng)侵襲的影響〔J〕.中華消化雜志，2013;33(1)：37-41.

4馮旺琴，崔竹梅，馮鳳芝，等.SLP-2 mRNA在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其意義〔J〕.中華婦產(chǎn)科雜志，2005;40(4)：553-7.

5Cao W，Zhang B，Li J，etal.SLP-2 overexpression could serve as a prognostic factor in node positive and HER2 negative breast cancer〔J〕.Pathology,2011;43(7)：713-8.

6Liu D，Zhang L，Shen Z，etal.Increased levels of SLP-2 correlate with poor prognosis in gastric cancer〔J〕.Gastric Cancer,2013;16(4)：498-504.

7Wang YQ，Cao WF，Yu ZC，etal.Downregulation of a mitochondria associated protein SLP-2 inhibits tumor cell motility，proliferation and enhances cell sensitivity to Chemo- therapeutic reagents〔J〕.Cancer Biol Ther，2009;17(151)：1651-8.

8Sprenger RR，Speijer D，Back JW，etal.Comparative proteomics of human endothelial cell caveolae and rafts using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry〔J〕.Electrophoresis，2004;25(1)：156-72.

9Hjek P，Chomyn A，Attardi G.Identification of a novel mitochondrial complex containing mitofusin 2 and stomatin-like protein 2〔J〕.J Biol Chem，2007;282(8)：5670- 81.

10Christie DA，Lemke CD，Elias IM，etal.Stomatin-like protein 2 binds cardiolipin and regulates mitochondrial biogenesis and function〔J〕.Mol Cell Biol,2011;31(18)：3845-56.

11Horiuchi A，Imai T，Wang C，etal.Up-regulation of small GTPases，RhoA and RhoC，is associated with tumor progression in ovarian carcinoma〔J〕.Lab Invest，2003;83(7)：861-70.

12祁代華，李建生，王康康.SLP-2和CDC42蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中華消化雜志，2009;29(2)：191-2.

13Cao W，Zhang B，Ding F，etal.Expression of SLP-2 was associated with invasion of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.PLoS One,2013;8(5)：e63890.