姜 偉

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

由于環(huán)境污染、吸煙等因素影響，肺癌是我國(guó)目前最主要的惡性腫瘤之一。在所有肺癌中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占75%～85%〔1〕，該類型肺癌治療不佳，5年存活率約為14%，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)于原癌基因和抑癌基因的探究和分析使得NSCLC的診斷和治療進(jìn)入了新的突破點(diǎn)，采用新的生物治療方法有可能使肺癌獲得更好的療效〔2〕。體內(nèi)外試驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)在上皮腫瘤(如肺癌)中核因子(NF)-κB/p65高表達(dá)，NF-κB能調(diào)節(jié)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制化療誘導(dǎo)的凋亡，在乳腺癌患者p65的活化能夠抵抗新的輔助化療。此外，NSCLC中最為常見的是環(huán)氧化酶(COX)-2過表達(dá)。COX-2是一種誘導(dǎo)酶，能被細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、癌基因和化學(xué)致癌物所激活〔3〕，本研究觀察NSCLC患者NF-κB/p65和COX-2的表達(dá)水平及其與臨床病理類型的關(guān)系和預(yù)后作用。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 2011年1月至2011年12月我院呼吸內(nèi)科NSCLC患者50例，納入標(biāo)準(zhǔn)為： ①治療過程中有完整的病例及隨訪資料包括常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)：血常規(guī)，肝、腎功能，生化檢驗(yàn)，肺活量檢測(cè)，胸部CT，神經(jīng)系統(tǒng)檢查以及體重變化情況，②體能狀態(tài)評(píng)分(ECOG)≤2，血液學(xué)參數(shù)正常。③纖維支氣管活檢檢查，并從相同病例體內(nèi)支氣管黏膜采集20例正常組織作為對(duì)照。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他部位惡性腫瘤，有嚴(yán)重臟器功能不全或者凝血功能障礙的患者，近期有嚴(yán)重感染性疾病，之前進(jìn)行過化放療或者手術(shù)的患者。均知情同意，并經(jīng)過我院的倫理委員會(huì)同意。根據(jù)國(guó)際評(píng)級(jí)體系確定臨床和病理學(xué)分級(jí)〔4〕。

1.2纖維支氣管鏡檢查 術(shù)晨空腹，檢查前30 min肌肉注射0.6 mg硫酸阿托品。使用10%利多卡因噴霧對(duì)上呼吸道進(jìn)行局部麻醉后支氣管鏡從鼻腔進(jìn)入；使用2%的利多卡因?qū)β晭?、氣管和下呼吸道進(jìn)行麻醉。對(duì)可見的腫瘤進(jìn)行組織活檢，并從支氣管樹的其他位置采集多點(diǎn)呼吸道內(nèi)膜組織樣本作為對(duì)照。觀察采集樣本，排除所有發(fā)育不良的組織，仔細(xì)將樣本分離并利用10%甲醛溶液固定。

1.3組織病理學(xué)試驗(yàn)和隨訪 使用蘇木精/伊紅染色進(jìn)行常規(guī)的組織病理學(xué)特征的評(píng)估并對(duì)腫瘤進(jìn)行評(píng)級(jí)〔4〕。然后進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)：將組織蠟塊切成3 μm的切片，在二甲苯中脫蠟30 min，在梯度酒精中水化。然后將組織切片浸入10 mm pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液(LabVisioncatalog#AP-9003)中，煮沸10 min，對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫冷卻20 min，再磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗1 min。將切片在3%的過氧化氫浸泡10 min阻斷內(nèi)源過氧化物酶，然后在PBS中沖洗。使用Ultra Vision Detection Kit(TP-015-HD,Lab Vision, USA)進(jìn)行免疫組化染色。使用Ultra V封閉10 min以減少非特異性背景，用PBS漂洗。接著在濕盒中孵育一抗〔兔單抗，抗COX-2(CloneSP21,Cat.No.RM-9121-R7,Readytouse,LabVision)和兔多抗，抗NFkB/p65(RelA) Ab-1(Cat.No.RB-1638-R7,Readytouse,LabVision)〕過夜，12 h后用PBS漂洗，用4～5滴UltraVision生物素耦聯(lián)的羊多價(jià)作為二抗覆蓋切片，室溫孵育10 min，再次用PBS沖洗，使用鏈霉親和素過氧化物酶溶液在室溫孵育10 min，PBS沖洗。滴加1滴DAB孵育15 min。最后用Mayer蘇木素復(fù)染，在酒精中脫水，然后加DPX。用已知的COX-2過表達(dá)的結(jié)腸癌患者的組織切片和NF-κB/p65過表達(dá)的前列腺癌患者的組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，使用未加一抗的樣品作為陰性對(duì)照。支氣管鏡檢查明確病理診斷后，根據(jù)臨床醫(yī)生的建議，對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)或者放化療，隨訪4～22(平均13)個(gè)月。

1.4免疫組化評(píng)估和評(píng)分 根據(jù)胞質(zhì)免疫組化染色差異反應(yīng)的細(xì)胞比例對(duì)COX-2表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。免疫染色樣本評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)反應(yīng)(0)，弱(+)，中()，強(qiáng)()。腫瘤細(xì)胞NF-κB表達(dá)陽(yáng)性是指呈現(xiàn)NF-κB核表達(dá)差異(NF-κB活化)。根據(jù)NF-κB的核定位進(jìn)行陽(yáng)性和陰性細(xì)胞的分類，在100倍顯微鏡觀察核染色陽(yáng)性細(xì)胞比例，分為<1%，1～10%，和>10%(陽(yáng)性)。每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)5個(gè)不同的區(qū)域取均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和log-Rank分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 20例早期病例(Ⅰ,Ⅱ,ⅢA期)中只有3例接受肺葉切除手術(shù)，其余無(wú)法手術(shù)或者拒絕手術(shù)。9例接受胸部放療，17例同時(shí)進(jìn)行了卡鉑/紫杉醇的化療以及胸部放療。剩余的晚期和有轉(zhuǎn)移病例(Ⅳ期)只接受含鉑藥物的化療，同時(shí)轉(zhuǎn)移部位局部接受放療。

2.2NF-κB/p65的免疫組化分析 見表1和圖1。腫瘤的惡性程度高、分期晚(Ⅲ和Ⅳ期)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者NF-κB/p65表達(dá)明顯升高。鱗狀細(xì)胞癌和腺癌患者NF-κB/p65的表達(dá)水平高于正常肺組織(P<0.01)；腺癌患者NF-κB/p65的表達(dá)水平高于鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌患者(P<0.01)。NF-κB的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、吸煙史、組織病理學(xué)類型、腫瘤級(jí)別、腫瘤分期和身體狀況顯著相關(guān)(P<0.05)。NF-κB/p65表達(dá)水平在1%，1%～10%和>10%的病例的平均生存時(shí)間分別為17.27，16和7個(gè)月；NF-κB陰性病例的平均生存時(shí)間為20.77個(gè)月，陰性患者生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。

表1 NF-κB、COX-2表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系〔n(%)〕

支氣管腺癌>10%的腫瘤細(xì)胞中NF-κB/p65核表達(dá)

支氣管鱗狀細(xì)胞癌>10%的腫瘤細(xì)胞中NF-κB/p65

支氣管大細(xì)胞癌1%～10%的腫瘤細(xì)胞中NF-κB/p65核表達(dá)

2.3COX-2表達(dá)的免疫組化分析 腫瘤惡性程度高，分期晚(Ⅲ和Ⅳ期)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者COX-2表達(dá)水平越高。所有腺癌病例(100%)COX-2表達(dá)陽(yáng)性，顯著高于鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌(P<0.01)。COX-2的表達(dá)水平與患者的性別、組織病理學(xué)類型、腫瘤等級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和身體狀況有關(guān)(P<0.05)。COX-2表達(dá)水平為(+),()和()的病例的存活平均時(shí)間分別為15.09，15.86和11個(gè)月，而COX-2表達(dá)陰性的患者存活時(shí)間為25.67個(gè)月，陰性患者生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。見表1和圖2。NSCLC患者免疫組化結(jié)果顯示COX-2和NF-κB/P65的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(χ2=58.682,P<0.001)。

支氣管腺癌

支氣管鱗狀細(xì)胞癌

支氣管大細(xì)胞癌

3 討 論

NF-κB的常見形式為由p65 和p50組成的異源二聚體〔5〕。在多數(shù)正常細(xì)胞中，NF-κB與其抑制物結(jié)合，其核定位序列被隱藏，定位于胞質(zhì)中。NF-κB調(diào)節(jié)多種在腫瘤發(fā)生中起重要作用的分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶，COX-2，iNOS，趨化因子和炎癥細(xì)胞因子等〔6〕，這些分子都能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和新生血管生成。NF-κB的p65亞基是一種參與細(xì)胞存活，周期分布和凋亡調(diào)控的基因〔7〕。Tang等〔8〕發(fā)現(xiàn)p65的表達(dá)對(duì)具有對(duì)抗塞來(lái)昔布介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用，說明NF-κB與細(xì)胞增殖調(diào)控和腫瘤形成之間存在密切的關(guān)系，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而且腫瘤細(xì)胞通過NF-κB獲得對(duì)抗癌藥物和放療的耐受性，因此抑制NF-κB的活化能改善抗癌藥物的療效〔9〕。Tang等〔8〕發(fā)現(xiàn)在多數(shù)(54%)NSCLC患者核表達(dá)水平高，與本研究結(jié)果一致，NF-κB/p65可以作為肺癌患者對(duì)于化療和放療應(yīng)答情況的預(yù)測(cè)指標(biāo)。本試驗(yàn)說明NF-κB/p65與腫瘤的惡性程度呈正比，是影響患者生存時(shí)間的反向指標(biāo)。Fidler 等〔10〕發(fā)現(xiàn)肺部腺癌患者中NF-κB/p65的表達(dá)水平在晚期腫瘤(Ⅲ和Ⅳ期)患者中更高，特別是在全身和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤中更高。

腫瘤可以誘導(dǎo)COX-2活化，并激活下游相關(guān)酶類(如PGE2)，這種作用能增強(qiáng)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，血管生成，降低宿主免疫功能，抵抗凋亡〔11〕。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中COX-2表達(dá)增加，特別是在腺癌中尤為明顯，這與之前的許多報(bào)道〔9〕一致。而且腺癌中COX-2的表達(dá)水平高于鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌,這說明腫瘤相關(guān)的COX-2表達(dá)上調(diào)也是侵襲型NSCLC發(fā)生發(fā)展的獨(dú)特標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)COX-2的致癌作用主要是通過提高前列腺素(如PGE2)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的〔12〕。COX-2的抑制劑已經(jīng)進(jìn)入前臨床和臨床試驗(yàn)階段，其能與放療和化療藥起到協(xié)同作用。非甾體抗炎藥能提高放療和化療的細(xì)胞毒性〔13〕。在臨床試驗(yàn)中，NSCLC患者在術(shù)前使用塞來(lái)昔布(一種選擇性COX-2抑制劑)能提高紫杉醇和卡鉑的應(yīng)答率。比如在Yoon等〔14〕進(jìn)行的試驗(yàn)中，將塞來(lái)昔布(COX-2的抑制劑)和化療藥物聯(lián)合使用比單純使用化療藥物治療晚期NSCLC(COX-2水平提高)的存活率更高。Lin等〔15〕也指出在COX-2過表達(dá)的肺癌患者使用塞來(lái)昔布治療獲得的存活率比沒有COX-2過表達(dá)患者的存活率要高。對(duì)于預(yù)后差的患者，COX-2表達(dá)可以作為一個(gè)治療靶點(diǎn)，選擇性COX-2抑制劑可能抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移并用于長(zhǎng)效維持治療中。

吸煙可能會(huì)誘導(dǎo)NF-κB調(diào)控的COX-2的表達(dá)，而塞來(lái)昔布能抑制這種誘導(dǎo)作用，這就證實(shí)了吸煙與肺癌發(fā)生之間存在著特定的機(jī)制。Zhan等〔16〕通過免疫組化指出NSCLC患者NF-κB的表達(dá)水平是整體存活率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，這與本試驗(yàn)結(jié)論是一致。活化的NF-κB直接發(fā)揮COX-2轉(zhuǎn)錄因子的作用。NSCLC患者NF-κB/p65和COX-2的表達(dá)水平具有預(yù)后意義，并且二者可以作為發(fā)展新的肺癌治療方法的靶點(diǎn)，抑制NF-κB和COX-2能增強(qiáng)抗癌治療的療效。

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