賈黎++++崔軍

[摘要] 目的 探討體外共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞與脂肪基質(zhì)細(xì)胞（ADSCs）用于軟骨構(gòu)建的可行性。 方法 分別收集并培養(yǎng)人ADSCs與豬耳軟骨細(xì)胞，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組、陰性對照組，分別接種ADSCs和軟骨細(xì)胞（以7∶3比例混合）、單純軟骨細(xì)胞、單純ADSCs，觀察并對比三組的形態(tài)學(xué)變化、濕重、蛋白多糖含量、組織學(xué)特征及Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。 結(jié)果 經(jīng)過8周的體外培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組組織形狀規(guī)則，表現(xiàn)出軟骨組織的結(jié)構(gòu)特征，且有一定的彈性；對于平均濕重及蛋白多糖定量檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的平均濕重可達(dá)陽性對照組的73.1%、81.9%，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本出現(xiàn)連續(xù)的軟骨樣組織，產(chǎn)生成熟的軟骨陷窩及纖維性組織，新生軟骨厚度較為明顯，Ⅱ型膠原免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組軟骨陷窩附近多處呈棕黃色，呈陽性反應(yīng)。結(jié)論 軟骨細(xì)胞及ADSCs體外共培養(yǎng)可用于軟骨組織的構(gòu)建，還需進(jìn)一步研究確定ADSCs轉(zhuǎn)化為成熟軟骨細(xì)胞的直接證據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 軟骨細(xì)胞；脂肪基質(zhì)細(xì)胞；共培養(yǎng)；軟骨構(gòu)建

[中圖分類號(hào)] R321[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-4721（2014）06（c）-0012-04

Experimental study of in vitro co-culture of chondrocytes and adipose-derived stromal cells for cartilage construction

JIA Li CUI Jun

Department of Stomatology,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518000,China

[Abstract] Objective To investigate the feasibility of in vitro co-culture of chondrocytes and adipose-derived stromal cells (ADSCs) for cartilage construction. Methods ADSCs and porcine auricular chomdrocytes were collected and cultured in vitro,and then three groups were set as the experimental group,the positive control group and the negative control group,which were inoculated ADSCs and chondrocytes(7∶3 mixing ratio),simple chondrocytes,simply ADSCs respectively.And the contrast morphological changes,the wet weight,the proteoglycan content changes and type Ⅱ collagen in the expression of histological feature of the three groups was observed and analyzed respectively. Results After eight weeks in vitro culture,the tissue of experimental group had a regular shape,which looked like the structure of cartilage tissue and was certain flexibility.For detection ofthe average wet weight and proteoglycan quantitative,the average wet weight and proteoglycan could reach 73.1%,81.9% of that in the positive experimental group respectively,which were significantly higher than that in the negative control group(P<0.01).HE staining showed that the experimental group occurred consecutive cartilage-like tissue,mature cartilage and fibrous tissue,and new cartilage thickness was more obvious.Type Ⅱ collagen immunohistochemical staining found that brownish yellow occurred near lacunas of cartilage in the experimental group. Conclusion Chondrocytes and ADSCs co-culture in vitro can be used to build cartilage,but further research is need to determine the direct evidence of ADSCs converted to mature chondrocytes.

[Key words] Chondrocytes;Adipose-derived stromal cells;Co-culture;Cartilage construction

近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)和生物材料研究的不斷發(fā)展，組織工程學(xué)逐漸成為新興的學(xué)科，其利用生物材料為載體將種子細(xì)胞置入體內(nèi)，并產(chǎn)生有功能組織，為組織損傷的修復(fù)提供新的思路和方法[1]。軟骨損傷是臨床較為常見的病癥，同時(shí)自我修復(fù)能力有限，往往導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、行走困難等不適，影響患者的生活質(zhì)量。目前，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的研究較多，但由于BMSCs的來源有限，大大限制了臨床應(yīng)用[2-3]。脂肪基質(zhì)細(xì)胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）是一類與BMSCs有相同表型特征和生物學(xué)特性且可多向分化的干細(xì)胞，因其分布范圍廣泛，體外增殖較快，逐漸成為新的骨組織工程種子細(xì)胞。多項(xiàng)研究顯示，與BMSCs相比，ADSCs的成軟骨分化能力較弱[4]，因此，如何誘導(dǎo)ADSCs的成軟骨分化及保持其穩(wěn)定表達(dá)軟骨表型成為臨床亟待解決的問題。一般對于誘導(dǎo)ADSCs的成軟骨分化往往通過添加大量的生長因子等進(jìn)行，但成本高，體內(nèi)誘導(dǎo)效果差[5]。國外研究發(fā)現(xiàn)，采用軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)成軟骨分化，成功構(gòu)建軟骨組織[6]。本研究采用軟骨細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)方式進(jìn)行成軟骨分化誘導(dǎo)，觀察其體外構(gòu)建成熟軟骨組織的能力，探究體外共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞與ADSCs構(gòu)建軟骨組織的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液由美國Hyclone公司生產(chǎn)；BGJb培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶由美國Gibco公司生產(chǎn)；Ⅱ型膠原購自美國Invitrogen公司；聚羥基乙酸、聚乳酸購自美國Sigma公司；離心設(shè)備選用德國Eppendorf 5810R臺(tái)式高速離心機(jī)；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 ADSCs的分離和培養(yǎng)

脂肪來源于行吸脂手術(shù)的健康成人16例，年齡27~38歲，平均（32.7±6.2）歲；抽脂部位包括腰部、腹部及大腿部；所有行抽脂術(shù)者均無傳染病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。取獲取的皮下脂肪50 ml置于超凈工作臺(tái)，采用含有1000 U/L青霉素和鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗，以除去血細(xì)胞及麻醉藥物，0.075%的Ⅰ型膠原酶處理，37℃振蕩消化60 min，300×g離心10 min收集下層沉淀細(xì)胞，并除去懸浮的脂肪細(xì)胞及脂滴，取BGJb培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并以3500/ml濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，間日換液，至細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

軟骨細(xì)胞取自豬耳廓部位，具體操作如下：無菌切取部分豬耳廓，除去皮膚及軟骨膜，采用眼科剪將其剪成3 mm×3 mm的片狀；加入0.2%Ⅱ型膠原酶消化處理過夜，至有單個(gè)細(xì)胞游離后，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化；采用移液器輕輕吹打，分離細(xì)胞團(tuán)，采用200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液；1500 r/min離心5 min，收集沉淀，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并以2.0×104/cm2的密度接種，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，間日換液，至細(xì)胞生長近匯合后，消化并收集細(xì)胞備用[7]。

1.4 PGA/PLA復(fù)合生物材料的制備[8]

稱取聚羥基乙酸（PGA）15 mg嵌入圓柱狀硅膠模具（直徑8 mm，高2 mm），采用二氯甲烷制備0.1%的聚乳酸（PLA）溶液，取0.5 ml滴加至嵌入PGA的硅膠模具內(nèi)，待其自然晾干，置于75%乙醇內(nèi)浸泡消毒30 min，后采用PBS反復(fù)沖洗，以確保除凈酒精，吸干備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與體外培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3組，分別為實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組、陰性對照組，每組設(shè)置6例標(biāo)本，其中實(shí)驗(yàn)組采用軟骨細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)，兩者按照3∶7的比例混合，接種200 μl濃度為5.0×107/ml的混合細(xì)胞懸液于預(yù)制的PGA/PLA支架上；陽性對照組及陰性對照組按照相同的接種量分別接種單純軟骨細(xì)胞及單純ADSCs。將接種好的PGA/PLA支架于37℃、5%CO2、飽和濕度下體外培養(yǎng)8周，取材檢測。

1.6 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的檢測

1.6.1 形態(tài)學(xué)觀察觀察內(nèi)容包括各組細(xì)胞-材料復(fù)合物經(jīng)體外培養(yǎng)后的大小、形狀、色澤等，并對比分析各組間的差異。

1.6.2 濕重及蛋白多糖定量檢測分別測定各組標(biāo)本的濕重及蛋白多糖含量，其中蛋白多糖的定量測定采用阿利辛藍(lán)法[9]進(jìn)行，對比分析各組間的差異。

1.6.3 HE染色檢測將培養(yǎng)8周后的組織采用10%福爾馬林溶液固定，制作石蠟切片，行HE染色，觀察細(xì)胞-材料復(fù)合物的組織結(jié)構(gòu)，如組織連續(xù)性、軟骨陷窩形成及生物材料的降解情況等。

1.6.4 Ⅱ型膠原表達(dá)的免疫組化檢測同上，制作石蠟切片，實(shí)驗(yàn)操作按照石蠟切片的免疫組化方法進(jìn)行，包括烘片、脫蠟、復(fù)水、漂洗、封閉等步驟，加入抗Ⅱ型膠原單克隆抗體（鼠抗人，英國Abcam公司），4℃孵育過夜，后采用PBS漂洗3次，加入生物素化的二抗（羊抗鼠，英國Abcam公司）孵育，后進(jìn)行DAB顯色及HE染色，并封片鏡檢，于熒光顯微鏡下觀察Ⅱ型膠原表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以x±s表示，采用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

經(jīng)過8周的體外培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組的組織形狀規(guī)則，表現(xiàn)出軟骨組織的結(jié)構(gòu)特征，有一定的彈性，其直徑及厚度較PGA/PLA支架無顯著變化，而陰性對照組未表現(xiàn)出軟骨組織特征，細(xì)胞-材料復(fù)合物結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)皺縮變形。

2.2 3組濕重及蛋白多糖含量的比較

實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組的平均濕重大于陰性對照組，平均蛋白多糖含量高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

表1 3組濕重及蛋白多糖含量的比較（x±s）

與陰性對照組比較，*P<0.01

2.3 各組HE染色及免疫組化結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)連續(xù)的軟骨樣組織，成熟的軟骨陷窩及纖維性組織產(chǎn)生，仍殘留少量PGA纖維，標(biāo)本內(nèi)部出現(xiàn)一定程度的松散，但新生軟骨厚度較明顯；陽性對照組多為均一的成熟軟骨組織，僅在中心位置處出現(xiàn)結(jié)構(gòu)松散；陰性對照組標(biāo)本未出現(xiàn)成熟軟骨陷窩，以纖維性組織為主。通過免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組的軟骨陷窩處呈陽性反應(yīng)，出現(xiàn)棕黃色，表明軟骨細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)成功誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化，而單純接種ADSCs的陰性對照組未呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，無Ⅱ型膠原表達(dá)（圖1）。

圖1 各組HE染色及免疫組化結(jié)果

a、d.實(shí)驗(yàn)組，b、e.陽性對照組，c、f.陰性對照組；a～c為HE染色結(jié)果，d～f為免疫組化結(jié)果

3 討論

目前，ADSCs的多向分化潛能被廣泛認(rèn)識(shí)，由于其來源廣泛，便于取材，且增殖活性高，逐漸代替BMSCs成為骨組織工程的種子細(xì)胞。在對軟骨組織損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)中，多項(xiàng)研究顯示ADSCs誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化的活性較BMSCs低，同時(shí)對于誘導(dǎo)條件（如生長因子、血清、氧分壓等）要求較高，單純采用ADSCs構(gòu)建軟骨組織并不能取得理想的效果[10]。近年來，有研究采用軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)，可以有效地誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，表明軟骨細(xì)胞的存在能夠?yàn)锽MSCs的定向誘導(dǎo)提供適宜的微環(huán)境[11]。鑒于ADSCs與BMSCs的結(jié)構(gòu)和功能的相似性，本研究通過體外共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞與ADSCs，觀察其軟骨組織定向誘導(dǎo)的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8周的體外培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組組織形狀規(guī)則，表現(xiàn)出軟骨組織的結(jié)構(gòu)特征，且有一定的彈性；對于平均濕重及蛋白多糖定量檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的平均濕重可達(dá)陽性對照組的73.1%、81.9%，同時(shí)與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本出現(xiàn)連續(xù)的軟骨樣組織，產(chǎn)生成熟的軟骨陷窩及纖維性組織，新生軟骨厚度較為明顯，Ⅱ型膠原免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組軟骨陷窩附近多處呈棕黃色，呈陽性反應(yīng)，表明軟骨細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)能夠成功誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化。

對于軟骨細(xì)胞如何誘導(dǎo)ADSCs定向分化的機(jī)制，可能原因如下：①軟骨細(xì)胞的存在，能夠分泌多種生長因子[12-13]，包括TGF-β、IGF1等，從而促進(jìn)ADSCs的定向分化；②軟骨細(xì)胞表面表達(dá)的整合素及細(xì)胞外基質(zhì)如Ⅱ型膠原等，構(gòu)成軟骨微環(huán)境，激活相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路，從而在ADSCs的定向分化中發(fā)揮作用[14]。目前具體機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步深入研究。本研究采用PGA/PLA支架進(jìn)行體外培養(yǎng)，主要是為了增加軟骨細(xì)胞與ADSCs間的接觸從而更好地發(fā)揮其誘導(dǎo)作用，同時(shí)便于軟骨組織均勻生長。對于軟骨細(xì)胞與ADSCs的比例選取，借鑒有關(guān)BMSCs與軟骨細(xì)胞體外共培養(yǎng)的報(bào)道[15-16]，同時(shí)考慮ADSCs定向誘導(dǎo)成軟骨分化的能力，選取以軟骨細(xì)胞∶ADSCs=3∶7的比例混合，但其是否是最佳的誘導(dǎo)比例還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。

綜上所述，軟骨細(xì)胞及ADSCs體外共培養(yǎng)可用于軟骨組織的構(gòu)建，但因共培養(yǎng)體系中含有30%的軟骨細(xì)胞，尚不足以明確證實(shí)ADSCs的確轉(zhuǎn)化為成熟的軟骨細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可采用熒光標(biāo)記的ADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，通過示蹤其誘導(dǎo)分化過程，從而為ADSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)成功誘導(dǎo)ADSCs定向分化為軟骨細(xì)胞提供直接證據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]呂曉杰，周廣東，劉霞，等.軟骨細(xì)胞與脂肪基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外構(gòu)建軟骨的初步研究[J].中華整形外科雜志，2012，28（1）：49-54.

[2]郭敦明，曹曉建，王芳，等.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化過程中基因表達(dá)譜變化[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（7）：1369-1373.

[3]孫明林，呂丹，朱雷，等.共培養(yǎng)系統(tǒng)下軟骨細(xì)胞對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用[J].中華骨科雜志，2011，31（9）：976-982.

[4]李寶軍，鄧展生，高嵩濤，等.脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（4）：505-509，514.

[5]陸偉，冀堃.脂肪組織來源干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志·電子版，2013，7（20）：9332-9335.

[6]馮均偉，王躍，呂波，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國組織工程研究，2013，17（36）：6409-6416.

[7]聶芳菲，潘柏林，李健寧，等.軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)和纖維蛋白凝膠支架皮下構(gòu)建組織工程軟骨[J].組織工程與重建外科雜志，2010，6（1）：5-8.

[8]梁耀中，查振剛，鄭力恒，等.BMSCs與PLGA支架構(gòu)建組織工程化骨軟骨復(fù)合組織[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2010，31（2）：168-173.

[9]Bjornsson S.Simultaneous preparation and quantitation of proteoglycans by precipitation with alcian blue[J].Anal Biochem，1993，210（2）：282-291.

[10]梁篤，樊粵光，王海彬，等.成人脂肪來源干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（4）：412-416，428.

[11]楊宏輝，蒲曉群，高傳玉，等.人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、分化和鑒定方法的研究[J].中國老年學(xué)雜志，2009， 29（19）：2491-2493.

[12]王洪林，閔繁紅，王巖峰，等.TGF-β1基因修飾誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國矯形外科雜志，2008，16（17）：1347-1350.

[13]周全，鄧展生，朱勇，等.胰島素樣生長因子1對人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（10）：1785-1790.

[14]李鵬，夏亞一.整合素介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)[J].國際骨科學(xué)雜志，2009，30（3）：158-161.

[15]苗春雷，段鵬，牟少春，等.軟骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外構(gòu)建軟骨組織的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志，2011，27（2）：113-118.

[16]康寧，劉霞，曹誼林，等.豬耳廓及關(guān)節(jié)來源軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志，2014， 30（1）：33-40.

（收稿日期：2014-03-09本文編輯：李亞聰）

綜上所述，軟骨細(xì)胞及ADSCs體外共培養(yǎng)可用于軟骨組織的構(gòu)建，但因共培養(yǎng)體系中含有30%的軟骨細(xì)胞，尚不足以明確證實(shí)ADSCs的確轉(zhuǎn)化為成熟的軟骨細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可采用熒光標(biāo)記的ADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，通過示蹤其誘導(dǎo)分化過程，從而為ADSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)成功誘導(dǎo)ADSCs定向分化為軟骨細(xì)胞提供直接證據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]呂曉杰，周廣東，劉霞，等.軟骨細(xì)胞與脂肪基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外構(gòu)建軟骨的初步研究[J].中華整形外科雜志，2012，28（1）：49-54.

[2]郭敦明，曹曉建，王芳，等.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化過程中基因表達(dá)譜變化[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（7）：1369-1373.

[3]孫明林，呂丹，朱雷，等.共培養(yǎng)系統(tǒng)下軟骨細(xì)胞對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用[J].中華骨科雜志，2011，31（9）：976-982.

[4]李寶軍，鄧展生，高嵩濤，等.脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（4）：505-509，514.

[5]陸偉，冀堃.脂肪組織來源干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志·電子版，2013，7（20）：9332-9335.

[6]馮均偉，王躍，呂波，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國組織工程研究，2013，17（36）：6409-6416.

[7]聶芳菲，潘柏林，李健寧，等.軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)和纖維蛋白凝膠支架皮下構(gòu)建組織工程軟骨[J].組織工程與重建外科雜志，2010，6（1）：5-8.

[8]梁耀中，查振剛，鄭力恒，等.BMSCs與PLGA支架構(gòu)建組織工程化骨軟骨復(fù)合組織[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2010，31（2）：168-173.

[9]Bjornsson S.Simultaneous preparation and quantitation of proteoglycans by precipitation with alcian blue[J].Anal Biochem，1993，210（2）：282-291.

[10]梁篤，樊粵光，王海彬，等.成人脂肪來源干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（4）：412-416，428.

[11]楊宏輝，蒲曉群，高傳玉，等.人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、分化和鑒定方法的研究[J].中國老年學(xué)雜志，2009， 29（19）：2491-2493.

[12]王洪林，閔繁紅，王巖峰，等.TGF-β1基因修飾誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國矯形外科雜志，2008，16（17）：1347-1350.

[13]周全，鄧展生，朱勇，等.胰島素樣生長因子1對人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（10）：1785-1790.

[14]李鵬，夏亞一.整合素介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)[J].國際骨科學(xué)雜志，2009，30（3）：158-161.

[15]苗春雷，段鵬，牟少春，等.軟骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外構(gòu)建軟骨組織的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志，2011，27（2）：113-118.

[16]康寧，劉霞，曹誼林，等.豬耳廓及關(guān)節(jié)來源軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志，2014， 30（1）：33-40.

（收稿日期：2014-03-09本文編輯：李亞聰）

綜上所述，軟骨細(xì)胞及ADSCs體外共培養(yǎng)可用于軟骨組織的構(gòu)建，但因共培養(yǎng)體系中含有30%的軟骨細(xì)胞，尚不足以明確證實(shí)ADSCs的確轉(zhuǎn)化為成熟的軟骨細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可采用熒光標(biāo)記的ADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，通過示蹤其誘導(dǎo)分化過程，從而為ADSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)成功誘導(dǎo)ADSCs定向分化為軟骨細(xì)胞提供直接證據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]呂曉杰，周廣東，劉霞，等.軟骨細(xì)胞與脂肪基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外構(gòu)建軟骨的初步研究[J].中華整形外科雜志，2012，28（1）：49-54.

[2]郭敦明，曹曉建，王芳，等.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化過程中基因表達(dá)譜變化[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（7）：1369-1373.

[3]孫明林，呂丹，朱雷，等.共培養(yǎng)系統(tǒng)下軟骨細(xì)胞對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用[J].中華骨科雜志，2011，31（9）：976-982.

[4]李寶軍，鄧展生，高嵩濤，等.脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（4）：505-509，514.

[5]陸偉，冀堃.脂肪組織來源干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志·電子版，2013，7（20）：9332-9335.

[6]馮均偉，王躍，呂波，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國組織工程研究，2013，17（36）：6409-6416.

[7]聶芳菲，潘柏林，李健寧，等.軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)和纖維蛋白凝膠支架皮下構(gòu)建組織工程軟骨[J].組織工程與重建外科雜志，2010，6（1）：5-8.

[8]梁耀中，查振剛，鄭力恒，等.BMSCs與PLGA支架構(gòu)建組織工程化骨軟骨復(fù)合組織[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2010，31（2）：168-173.

[9]Bjornsson S.Simultaneous preparation and quantitation of proteoglycans by precipitation with alcian blue[J].Anal Biochem，1993，210（2）：282-291.

[10]梁篤，樊粵光，王海彬，等.成人脂肪來源干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（4）：412-416，428.

[11]楊宏輝，蒲曉群，高傳玉，等.人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、分化和鑒定方法的研究[J].中國老年學(xué)雜志，2009， 29（19）：2491-2493.

[12]王洪林，閔繁紅，王巖峰，等.TGF-β1基因修飾誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國矯形外科雜志，2008，16（17）：1347-1350.

[13]周全，鄧展生，朱勇，等.胰島素樣生長因子1對人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（10）：1785-1790.

[14]李鵬，夏亞一.整合素介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)[J].國際骨科學(xué)雜志，2009，30（3）：158-161.

[15]苗春雷，段鵬，牟少春，等.軟骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外構(gòu)建軟骨組織的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志，2011，27（2）：113-118.

[16]康寧，劉霞，曹誼林，等.豬耳廓及關(guān)節(jié)來源軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志，2014， 30（1）：33-40.

（收稿日期：2014-03-09本文編輯：李亞聰）