朱婷婷，林彤遠(yuǎn)，羅 晴，洪小丹，陳衛(wèi)東

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省高等學(xué)校省級現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥 230012)

·方藥研究·

楊梅素混合膠束的研制及其體外表征研究

朱婷婷1，2，林彤遠(yuǎn)1，2，羅 晴1，2，洪小丹2，陳衛(wèi)東1，2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省高等學(xué)校省級現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥 230012)

目的研制載有楊梅素(myricetin，Myr)的聚乙二醇-聚乳酸(polyethylene glycol-polylactic acid, mPEG-PLA)/Pluronic F68混合膠束(mixed micelles，MMs)，并對Myr-MMs進行表征及體外釋放研究。方法通過丙酮溶劑揮發(fā)法研制Myr-MMs，以單因素及L9(34)正交實驗優(yōu)化處方及其工藝；并對制得的載藥MMs的粒徑、Zeta電位、外觀形態(tài)、包封率、載藥量和體外釋放進行研究。結(jié)果最優(yōu)處方制得的Myr-MMs的包封率為(84.65±0.98)%、載藥量為(2.73±0.03)%；透射電鏡下觀察Myr-MMs呈球形或類球形、表面光滑、無粘連；粒徑為(41.74±0.27)nm，多分散系數(shù)為0.115±0.004；Zeta電位為(-25.47±1.22)mV；體外釋放研究發(fā)現(xiàn)，MMs體外釋藥過程近似符合Weibull釋藥模型：ln(ln(1/(1-Q/100)))=0.927 1lnt-2.057 6(r=0.953 8)。結(jié)論利用丙酮溶劑揮發(fā)法成功研制了Myr-MMs，其成型好、粒徑小、分布均勻，包封率和載藥量均較高；且Myr經(jīng)mPEG-PLA/Pluronic F68 包裹后其體外釋放顯示出一定的緩釋效果。

楊梅素；混合膠束；mPEG-PLA/Pluronic F68；體外釋放

楊梅素(myricetin，Myr)又名楊梅樹皮素、楊梅黃酮、楊梅酮，屬于黃酮類化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素具有廣泛的藥理作用[1]，如抗血小板活化因子、抗氧化、抗腫瘤﹑降血脂﹑保肝護肝等。但由于其水溶性低，口服吸收差，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。選用合適的載藥體系提高Myr的溶解度，同時降低其不良反應(yīng)成為目前研究的熱點[2-4]。擁有溶解性差異很大的疏水端和親水端的兩親性嵌段共聚物，可在水性環(huán)境中組裝成介觀尺寸范圍的聚合物膠束(polymeric micelles，PM)[5]。PM由于其特殊的核-殼結(jié)構(gòu)，具有非常小的粒徑范圍，疏水鏈段從親水外側(cè)被隔開，形成了一個內(nèi)核，外側(cè)被親水性鏈段包圍。然而單一聚合物自組裝形成的PM由于鏈段數(shù)量的限制，存在載藥量低﹑穩(wěn)定性差﹑生物利用度低等問題[6-7]。近年來出現(xiàn)了大量有關(guān)混合膠束(mixed micells,MMs)的研究報道，MMs是由2種或2種以上兩親性聚合物按一定比例混合而得到的膠束體系，與單一膠束比較，包載的藥物及其穩(wěn)定性均得到很大的提高[8-10]。

本實驗以聚乙二醇-聚乳酸(polyethylene glycol-polylactic acid, mPEG-PLA)及Pluronic F68為載體材料，采用丙酮溶劑揮發(fā)法制備Myr-MMs，同時考察了MMs的理化性質(zhì)，并以Myr原料藥為對照，考察其體外釋放特征。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀：LC20-ABSPD-M20A紫外檢測器及島津LC-solution色譜工作站；UV-2550紫外可見分光光度計：日本島津公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；AB125-S型十萬分之一分析天平：德國梅德勒公司；KQ-300B型超聲波清洗儀：江蘇省昆山超聲儀器有限公司；LC-4016低速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Zetasizer 3000HS型激光粒度分度與Zeta電位分析儀：英國Malvern儀器公司；UV-1750紫外分光光度儀：日本島津公司；0.22 μm微孔濾膜：上海半島實業(yè)有限公司凈化器材廠；透析袋：BIOSHARP 公司；JEM-2100型透射電鏡：日本JEOL儀器公司。

1.2 試劑與試藥 Myr(≥98%，批號 YMS20121214)：西安萬昌生物科技有限公司；Pluronic F68(批號 WPYH570B)：北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；mPEG2000-PLA8000(批號 DG-MPEG-PLA145923)：山東省濟南岱罡生物工程有限公司；甲醇為色譜純；其余試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Myr-MMs的制備 采用丙酮溶劑揮發(fā)法制備Myr-MMs，具體步驟如下：稱取適量的Myr和mPEG2000-PLA8000，溶于丙酮中形成油相；稱取一定量的Pluronic F68，溶于蒸餾水形成水相；將油相在攪拌(1 000 r/min)下勻速逐滴加入水相，揮發(fā)過夜，直至揮干丙酮，過0.22 μm微孔濾膜，即得到Myr-MMs溶液。

2.2 藥物含量測定

2.2.1 色譜條件：島津LC-15C高效液相色譜儀：LC-15C高壓輸液泵、SPD-15C紫外檢測器；色譜柱：COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；進樣量：20 μL；流動相：甲醇-0.2%磷酸(65∶35)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；溫度：30 ℃。

2.2.2 專屬性試驗：Myr-MMs和空白MMs供試品溶液的配制：精密量取Myr-MMs溶液0.5 mL至10 mL量瓶中，加入甲醇并定容至刻度，0.22 μm的微孔濾膜濾過后即得Myr-MMs供試品溶液；同法制得空白MMs供試品溶液。對照品溶液的配制：精密稱取Myr 5.00 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL，得50.00 μg/mL的Myr對照品儲備液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分別取對照品溶液、供試品溶液，在上述色譜條件下分別進樣20 μL，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1，表明所用輔料對Myr的測定無干擾。

注：A. Myr溶液；B. Myr-MMs；C. 空白MMs。

圖1 Myr高效液相色譜圖

2.2.3 線性關(guān)系考察：分別取適量Myr儲備液以色譜甲醇定容，配制0.05、0.10、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 μg/mL的Myr溶液，0.22 μm的微孔濾膜過濾，按“2.2.1”項下色譜條件進樣20 μL，記錄峰面積。以峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程y=74 402x-4 411.7(r=0.999 8)，結(jié)果表明Myr在0.05～16.00 μg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗：配制Myr低濃度(0.10 μg/mL)、中濃度(2.00 μg/mL)、高濃度(12.80 μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)Myr溶液，分別按“2.2.1”項下方法進樣，于1個工作日內(nèi)連續(xù)進樣3次，求算日內(nèi)精密度；于3個工作日內(nèi)連續(xù)進樣，每日1次，求算日間精密度。日內(nèi)RSD分別為2.00%、1.23%、0.44%，日間RSD分別為2.73%、1.44%、0.62%。

2.2.5 重復(fù)性試驗：取Myr-MMs樣品液1 mL稀釋至刻度10 mL，平行制得6份，0.22 μm微孔濾膜過濾，按“2.2.1”項下色譜條件進樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果RSD為1.67%，表明重復(fù)性良好。

2.2.6 回收率試驗：分別取50.00 μg/mL對照品液320、400、480 μL，加入0.5 mL空白MMs，定容至10 mL，所得濃度即為1.60、2.00、2.40 μg/mL含MMs供試液。每個濃度平行配制3份樣品，分別進樣，計算峰面積。低濃度(1.60 μg/mL)、中濃度(2.00 μg/mL)、高濃度(2.40 μg/mL)的平均回收率分別為98.6%、100.6%、95.0%。

2.3 包封率和載藥量測定 本實驗采用超濾離心法作為分離Myr-MMs和游離Myr的方法，并采用高效液相色譜法測定游離Myr和MMs中總Myr含量，通過計算得到Myr-MMs的包封率與載藥量。精密量取1.0 mL Myr-MMs溶液置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，輕輕搖勻，取4 mL加至超濾離心管(截留相對分子質(zhì)量為100 K)內(nèi)管中，3 500 r/min 離心30 min，超濾液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后取20 μL進樣，計算游離藥量(Wfree)。另精密量取0.2 mL Myr-MMs溶液置10 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲2 min破乳后，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm濾膜過濾后取20 μL續(xù)濾液進樣測定，記錄峰面積，計算總藥量(Wtotal)。

包封率=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%。

載藥量=(Wtotal-Wfree)/(Wtotal-Wfree+Wmaterial)×100%。

式中Wmaterial指系統(tǒng)的載體材料總質(zhì)量。

2.4 處方和工藝的優(yōu)化

2.4.1 單因素實驗：以包封率為考察指標(biāo)，對處方的其他各影響因素進行初步篩選。結(jié)果顯示投藥量、載體材料總量、載體材料比(F68∶mPEG2000-PLA8000)、有機溶劑量等對包封率影響顯著，故其具體用量在正交試驗中進一步考察。

2.4.2 正交試驗：本單因素實驗篩選出4個主要影響因素：投藥量(A)、載體材料總量(B)、載體材料比(F68∶mPEG2000-PLA8000)(C)、有機溶劑量(D)，因素水平見表1。根據(jù)正交試驗設(shè)計的原理，選擇L9(34)正交表設(shè)計試驗。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。以包封率為考察指標(biāo)時，由表中極差分析可知，各因素影響的主次順序是A、B、C、D，說明投藥量、載體材料總量、載體材料比、有機溶劑量對包封率的影響逐漸減小，最優(yōu)處方組合是A2B2C3D2。由方差分析可知，投藥量對包封率有顯著影響。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果(n=3)

表3 方差分析結(jié)果

2.4.3 驗證實驗：按照最優(yōu)處方制備3批。測定包封率，結(jié)果包封率分別為83.99%、84.18%、85.77%。結(jié)果顯示，包封率較高且重復(fù)性較好。

2.5 Myr-MMs理化性質(zhì)的研究

2.5.1 粒徑及Zeta電位測定：粒徑是評價納米粒子一項重要指標(biāo)，粒徑大小及分布直接影響著分散體系的物理穩(wěn)定性。取Myr-MMs平行3份，室溫稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用激光粒度分布儀測定其粒徑及粒度分布，同法測定其Zeta電位。載藥膠束的粒徑和粒徑分布見圖2。由圖2可以看出，平均粒徑為(41.74±0.27)nm，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)為(0.115±0.004)，粒徑分布較窄。載藥膠束與空白膠束的粒徑無明顯差別。Zeta電位平均為(-25.47±1.22)mV。

2.5.2 形態(tài)學(xué)觀察：將Myr-MMs滴于電鏡制樣銅網(wǎng)上，1.5%磷鎢酸負(fù)染，用濾紙吸取多余染液，銅網(wǎng)于室溫下自然干燥后，放入透射電鏡中，觀察形態(tài)并照相，見圖3。結(jié)果表明，Myr-MMs呈球形或類球形、表面光滑、無黏連，邊緣較模糊，內(nèi)核外有一冠狀層，能明顯看出膠束的核-殼結(jié)構(gòu)。制得的載藥膠束Myr-MMs粒徑在47.89 nm左右，與激光粒度分布儀測得的平均粒徑基本一致，能很好地反映膠束的形態(tài)和粒徑分布。

圖2 Myr?MMs粒徑分布圖圖3 透射電鏡下Myr?MMs形態(tài)(1×500000倍)

2.5.3 初步穩(wěn)定性考察：將新鮮制備的Myr-MMs溶液密封于西林瓶中，置于4 ℃、25 ℃、60 ℃的恒溫箱中，于0、5、15、30 d分別取樣測量粒徑；同時超濾離心Myr-MMs溶液，測定包封率大小，考察膠束中藥物的泄露情況。結(jié)果見表4。

表4 初步穩(wěn)定性考察

結(jié)果表明，在60 ℃下，隨著放置時間的增加，Myr-MMs的粒徑逐漸增加，且增大的趨勢很大，PDI增加較明顯，說明MMs粒子間發(fā)生了聚集；包封率逐步減少，放置30 d后由84.65%減少至55.29%，發(fā)生了較為嚴(yán)重的泄露。由此可見，Myr-MMs對熱不穩(wěn)定，應(yīng)避免在高溫下貯存。而在室溫下(25 ℃)放置30 d，膠束的粒徑只發(fā)生較小的變化(由41.74 nm變?yōu)?7.83 nm)，PDI變化較為微小，由0.115增加至0.139；而包封率由84.65%減少至80.41%，約有5.00%的泄露。低溫(4 ℃)放置30 d后，Myr-MMs的粒徑、PDI、包封率基本無變化，表明室溫或者低溫條件下藥物可穩(wěn)定存在于Myr-MMs內(nèi)核中。

2.6 Myr-MMs的體外釋放研究

2.6.1 色譜條件：同“2.2.1”項。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取Myr儲備液適量，加pH 2.0緩沖液配制濃度分別為0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。同“2.2.3”項操作。Myr在0.05～10.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=22 949x+1 459.6(r=0.999 8)。

2.6.3 專屬性試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液，在上述色譜條件下分別進樣20 μL，記錄色譜圖。結(jié)果表明此釋放介質(zhì)對Myr的測定無干擾。

2.6.4 精密度實驗：取Myr對照品溶液低濃度(0.10 μg/mL)﹑中濃度(1.00 μg/mL)﹑高濃度(8.00 μg/mL)分別在日內(nèi)和日間連續(xù)進樣3 d。日內(nèi)RSD分別為2.05%、1.33%、1.04%，日間RSD分別為1.42%、0.77%、1.71%。

2.6.5 重復(fù)性實驗：平行制得Myr-MMs樣品液6份，進樣，計算峰面積。計算得RSD為1.19%，重復(fù)性良好。

2.6.6 回收率實驗：配制低、中、高濃度的對照品溶液，分別取160、200、240 μL的50 μg/mL對照品液，加入0.5 mL空白MMs，定容至10 mL，所得濃度即為0.80、1.00、1.20 μg/mL。平行配制3份樣品，分別進樣，計算峰面積。低濃度(0.80 μg/mL)、中濃度(1.00 μg/mL)、高濃度(1.20 μg/mL)的平均回收率分別為96.5%、100.2%、99.5%。

2.6.7 體外釋放度的測定：本研究采用透析法對所制備的Myr-MMs的體外釋藥特征進行考察，以Myr溶液的釋放特征為對照，評價Myr經(jīng)MMs包載后釋放行為的變化。分別取1 mL Myr-MMs和等含量的Myr溶液置于預(yù)先處理好的透析袋(21 mm，8 000～14 400 Da)中，扎緊兩端，放入溶出杯中。釋放介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液(pH 2.0，加0.5%Tween80)，釋放介質(zhì)容積為40 mL，在37 ℃下100 r/min低速攪拌，平行操作3份。在0、0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、36、48 h取樣1 mL，同時補加等量等溫釋放介質(zhì)，0.22 μm微孔濾膜過濾后，進樣20 μL，高效液相色譜法測定，并按下列公式計算累積釋藥百分比(Q)，繪制釋放曲線，見圖4。

Q=[ci×V1+(c1+c2+… +ci-1)×V2]/M×100%。

式中c1、c2、ci-1，ci分別為第1、2、i-1、i等時間點釋放介質(zhì)中Myr濃度，V1釋放介質(zhì)總?cè)莘e；V2所取的樣容積，M為投藥量。

由結(jié)果可知，Myr從溶液中釋放迅速，4 h后幾乎全部釋放，累積釋放率達到102.06%。Myr-MMs載體中藥物的釋放呈現(xiàn)兩相特征，即開始階段的快速釋放相和緩釋相，在48 h后累積釋放率為90.11%。

圖4 Myr和Myr-MMs的體外釋藥特征

對Myr溶液及Myr-MMs的釋放動力學(xué)按照零級﹑一級、Higuchi方程、Weibull方程和Ritger-Peppas方程進行擬合，所得回歸方程見表5。結(jié)果表明Myr溶液體外釋放特征符合Higuchi模型，而Weibull方程能很好地描述Myr-MMs的釋放特征，Myr-MMs的釋放動力學(xué)方程是ln(ln(1/(1-Q/100)))=0.927 1lnt-2.057 6(r=0.953 8)。

表5 釋放特征擬合結(jié)果

3 討論

膠束的形成是通過有機溶劑的擴散自組裝形成的，因此有機溶劑在水相中的擴散速度及有機溶劑對藥物及載體材料的溶解能力，直接影響到所得膠束的包封率及粒徑[11]。本實驗中選擇了四氫呋喃、無水乙醇、乙腈、丙酮等不同有機溶劑來制備Myr-MMs，并考察其對包封率及粒徑的影響。結(jié)果顯示應(yīng)用四氫呋喃、無水乙醇、乙腈所制備的MMs的包封率和粒徑均不理想，而采用丙酮制備的MMs有著較高的包封率及較小的粒徑。

本實驗以F68和mPEG2000-PLA8000為載體材料制備MMs。通過查閱文獻[7-10]，制備方法較多使用的有薄膜分散法與透析法。由于mPEG2000-PLA8000的水溶性差，藥物與載體形成的膜水化后出現(xiàn)針狀結(jié)晶，藥物與載體不能在水化液中自組裝成MMs；透析法所得到的膠束粒徑較大且不均一，時間長；故綜合藥物與載體的理化特性及實驗條件，選擇丙酮溶劑揮發(fā)法作為Myr-MMs的制備方法。

由于Myr在水中的溶解度低，在pH 2.0的磷酸鹽緩沖液中加入0.5% Tween80[12]。Myr-MMs的體外釋放行為主要可分為兩相，即突釋相與緩釋相。藥物在前4 h內(nèi)從Myr-MMs內(nèi)突釋約61.63%，該部分突釋的藥物可能是吸附在膠束外殼或是粒子表面的游離藥物[13]；由于親水層mPEG的保護使得包裹在MMs內(nèi)部的藥物與水相接觸的較少，釋放較為緩慢，48 h后約釋放90.11%，顯示出一定的緩釋效果。

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PreparationofMyricetin-loadedMixedMicellesComposedofMethoxyPolyethyleneGlycol-PolylacticAcid/PluronicF68andStudyonItsCharacteristicsandInVitroReleaseProfile

ZHUTing-ting1,2,LINTong-yuan1,2,LUOQing1,2,HONGXiao-dan2,CHENWei-dong1,2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnhuiKeyLaboratoryofModernizedChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo prepare myricetin-loaded mixed micelles composed of methoxy polyethylene glycol-polylactic acid/Pluronic F68 (Myr-MMs) and to study the characteristics andinvitrorelease profile of Myr-MMs.MethodsThe Myr-MMs were prepared by acetone solvent evaporation, and the formula and process were optimized by single-factor test and L9(34) orthogonal experiment. The particle sizes, Zeta potential, appearance, encapsulation efficacy, drug loading, andinvitrorelease of Myr-MMs were studied.ResultsThe encapsulation efficiency and drug loading of Myr-MMs based on the optimized formula were (84.65±0.98)% and (2.73±0.03)%, respectively. The Myr-MMs were spherical or near-spherical, showed smooth surfaces, and had no adhesion, according to transmission electron microscopy. The mean particle size, polydispersity index, and Zeta potential were (41.74±0.27) nm, (0.115±0.004), and (-25.47±1.22)mV, respectively. Theinvitrorelease profile of Myr-MMs followed the Weibull equation: In(In(1/(1-Q/100))) = 0.927 1Int-2.057 6 (r=0.953 8).ConclusionMyr-MMs can be successfully prepared by acetone solvent evaporation, have good appearance, small and uniform particle sizes, and high encapsulation efficiency and drug loading, and show sustainedinvitrorelease.

myricetin; mixed micelles; methoxy polyethylene glycol-polylactic acid/Pluronic F68;invitrorelease

朱婷婷(1989-)，女，碩士研究生

陳衛(wèi)東，anzhongdong@126.com

R283

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.020

2014-11-18)