沈 斌，鮑遠(yuǎn)程，蔣懷周，張 娟，王艷昕，方 向

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心，安徽 合肥 230031；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038)

肝豆靈對(duì)Wilson病模型大鼠肝組織miRNA-122表達(dá)的影響

沈 斌1，鮑遠(yuǎn)程2，蔣懷周3，張 娟2，王艷昕2，方 向2

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心，安徽 合肥 230031；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038)

目的研究肝豆靈對(duì)Wilson病(Wilson’s disease, WD)大鼠肝組織miRNA-122表達(dá)的影響，探究其保護(hù)肝臟的機(jī)制。方法將24只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、青霉胺組和肝豆靈組。銅負(fù)荷喂養(yǎng)8周后，分別用青霉胺、肝豆靈以成人等效劑量灌胃，空白對(duì)照組及模型組均以等量生理鹽水灌胃，每組均灌胃4周。觀(guān)察各組大鼠肝功能及肝組織miRNA-122的表達(dá)水平。結(jié)果肝豆靈和青霉胺均可顯著降低WD大鼠異常升高的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)(P<0.05，或P<0.01)，顯著升高WD大鼠肝組織異常降低的miRNA-122表達(dá)水平(P<0.01)。肝豆靈降低血清ALT、AST和TBil的作用及升高肝組織miRNA-122表達(dá)的作用顯著優(yōu)于青霉胺(P<0.05，或P<0.01)。結(jié)論肝豆靈保護(hù)WD大鼠肝功能的作用與其上調(diào)肝組織miRNA-122的表達(dá)有關(guān)。

肝豆?fàn)詈俗冃?；肝豆靈；青霉胺；miRNA-122

肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration，HLD)，又稱(chēng)Wilson病(Wilson disease，WD)，是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病。在WD臨床病程中，以肝臟損害表現(xiàn)最為常見(jiàn)，首發(fā)癥狀中也最為多見(jiàn)。筆者在運(yùn)用肝豆靈片治療WD的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。因此，筆者通過(guò)復(fù)制WD大鼠模型，探究肝豆靈的保肝作用機(jī)制，以期為臨床防治WD患者肝損害提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)Wistar大鼠24只，雌性，月齡均為3個(gè)月，平均體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2013-01。動(dòng)物房為普通級(jí)飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組6只，分別為空白對(duì)照組、模型組、青霉胺組、肝豆靈組。

1.2 儀器 ASCA全自動(dòng)生化分析儀：美國(guó)Microgenics儀器公司；HH-W21-600型電熱恒溫水浴箱：上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠(chǎng)；FA2004型電子天平：上海天平儀器廠(chǎng)；XK96-B混勻器：江蘇姜堰新康儀器廠(chǎng)；101-A恒溫干燥箱：寧波自動(dòng)化儀表廠(chǎng)；潔凈工作臺(tái)：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；9700型基因擴(kuò)增儀：美國(guó)Applied Biosystems公司；引物設(shè)計(jì)軟件：Primer 5.0；ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 試劑 硫酸銅(批號(hào) 201203)：中科銅都粉體新材料股份有限公司；TRIzol試劑(P/N15596-018)：美國(guó)Invitrogen公司；反向引物：上海百力格生物技術(shù)有限公司；PCR引物：由上?？党缮镉邢薰竞铣桑辉噭閲?guó)產(chǎn)分析純，武漢康盛醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)藥物 肝豆靈由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供(批號(hào)為皖藥制字Z20050071)，每盒150片，每片0.3 g，主要由石菖蒲、丹參、姜黃、莪術(shù)、郁金、黃連、大黃、金錢(qián)草等藥物組成。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 從實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始，除空白對(duì)照組予以普通飼料，其余3組均參照文獻(xiàn)[1]復(fù)制銅負(fù)荷大鼠模型，即予含硫酸銅1.0 g/kg的飼料和0.185%硫酸銅的水，喂養(yǎng)12周；各組大鼠每天自由進(jìn)食并自由飲水。

2.2給藥方法

2.2.1 肝豆靈組：從第7周第1天開(kāi)始，每日每只大鼠按0.486 g/kg將肝豆靈溶于生理鹽水予以灌胃，每日1次，共6周。

2.2.2 青霉胺組：從第7周第1天開(kāi)始，每日每只大鼠予以青霉胺0.09 g/kg，每日1次，共6周。

2.2.3 空白對(duì)照組和模型組：給予等容量生理鹽水，連續(xù)6周。

2.3 標(biāo)本留取 各組動(dòng)物在第13周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12 h，處死動(dòng)物。乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行肝功能生化檢測(cè)。取肝組織液氮速凍后存于-80 ℃冰箱，用于miRNA-122檢測(cè)。

2.4 肝功能檢測(cè) 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和總膽紅素(total bilirubin，TBil)由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2.5 RNA提取 采用TRIzol法提取RNA。每50～100 mg組織樣品，加入1 mL TRIzol試劑，用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿。所加樣品體積不能超過(guò)勻漿此樣品所使用的TRIzol試劑體積的10%。按照RecoverAllTM總核酸提取試劑盒(Ambion， Austin)的操作說(shuō)明書(shū)，從組織懸液中提取總RNA。紫外分光光度計(jì)用于評(píng)估RNA的濃度和純度。將所有RNA樣品置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 miRNAs反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增 ①cDNA的合成：RT混合反應(yīng)液由2 μL dNTP、2 μL 10×RT Buffer、0.3 μL RT特異引物、1 000 ng總RNA、0.1 μL MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、0.3 μL RNA酶抑制劑組成，加無(wú)RNA酶水至20 μL。②RT-PCR反應(yīng)：在9700型基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行，16 ℃ 30 min，42 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用或-20 ℃保存。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)采用美國(guó)Life Technologies公司的ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系。體系配置中有5 μL 2×Master Mix、0.5 μL 10 μmol/L的PCR特異引物F、0.5 μL 10 μmol/L的PCR特異引物，引物序列見(jiàn)表1，最后加雙蒸水至8 μL。②實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃，10 s；60 ℃，60 s)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按照“95 ℃，10 s→60 ℃，60 s→95 ℃，15 s”的順序控制反應(yīng)溫度，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃(每秒升高0.05 ℃)。各樣品的目的miRNA和內(nèi)參(U6)分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝功能比較 與空白對(duì)照組比較，模型組ALT、AST、TBil水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，青霉胺組和肝豆靈組ALT、AST、TBIL水平顯著降低(P<0.01)；肝豆靈組ALT、AST和TBIL水平顯著低于青霉胺組(P<0.05，或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較

注：與空白對(duì)照組比較，△△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與青霉胺組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各組大鼠肝組織miRNA-122表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組miRNA-122表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，與模型組比較，青霉胺組、肝豆靈組miRNA-122表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，或P<0.01)；肝豆靈組miRNA-122表達(dá)水平顯著高于青霉胺組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肝組織miRNA-122表達(dá)水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與青霉胺組比較，*P<0.05。

4 討論

目前臨床常采用ALT和AST作為肝損傷的標(biāo)記物，這兩種轉(zhuǎn)氨酶在人體多個(gè)組織中均有分布，缺乏特異性[2]。在病毒性肝炎、脂肪肝、藥物性肝炎、肝癌、酒精性肝炎等肝臟疾病中，ALT因肝細(xì)胞損傷或通透性增加，釋放入血引起血液中ALT升高。WD模型大鼠因銅過(guò)量沉積引起肝組織破壞，ALT升高。肝特異性miRNA-122作為首個(gè)臨床藥物受到越來(lái)越多的關(guān)注[3]，miRNA-122可能參與了肝臟的發(fā)育分化[4]，在維持肝臟的正常功能代謝上起著重要的作用[5-6]，在目前常見(jiàn)的肝臟疾病(如病毒性肝炎、肝癌、肝硬化)中起到了很重要的調(diào)控作用[7-10]。一些研究發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-122水平與ALT水平呈正相關(guān)關(guān)系，且升高的時(shí)間段更早，推測(cè)ALT可作為肝損傷的早期標(biāo)志物[10]。

前期大量的基礎(chǔ)和臨床研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，WD肝損傷的基本病機(jī)為濕熱內(nèi)蘊(yùn)、痰瘀互結(jié)，具有通腑利尿、化瘀散結(jié)作用的中藥專(zhuān)方肝豆靈片，可以改善WD患者的肝功能指標(biāo)。肝豆靈片以石菖蒲、丹參為君藥，石菖蒲辟穢開(kāi)竅、宣氣逐痰；丹參專(zhuān)入血分，內(nèi)達(dá)臟腑，能化瘀滯，與丹參共奏祛痰化瘀之功。姜黃破血行氣、通經(jīng)止痛；莪術(shù)行氣破血、消積止痛；郁金行氣化瘀、清心解郁、利膽退黃。三藥合用軟堅(jiān)散結(jié)，共為臣藥。大黃瀉熱通腑、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)，《日華子本草》謂大黃“通宣一切氣，調(diào)血脈，利關(guān)節(jié)，泄壅滯、水氣，四肢冷熱不調(diào)，溫瘴熱痰，利大小便，并敷一切瘡癤癰毒”。黃連瀉火解毒、清熱燥濕。大黃、黃連共為佐藥，奏清熱通腑之功。金錢(qián)草利水通淋、清熱解毒、散瘀消腫，又可引諸藥入肝膽經(jīng)，為使藥?？v觀(guān)全方，肝豆靈不僅以通腑利濕之法促進(jìn)銅毒的排出，同時(shí)佐以化痰散結(jié)之法以治“積聚”“癥瘕”，標(biāo)本同治。

本研究結(jié)果表明，WD模型大鼠血清ALT、AST、TBil顯著升高，肝豆靈可顯著降低異常升高的ALT、AST和TBIL，同時(shí)肝豆靈能夠提高肝組織中miRNA-122的表達(dá)水平。結(jié)果提示，肝豆靈改善肝功能的機(jī)制可能與上調(diào)肝組織中miRNA-122的表達(dá)有關(guān)。

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EffectofGandoulingonmiRNA-122ExpressioninLiverTissuesinRatModelofWilson’sDisease

SHENBin1,BAOYuan-cheng2,JIANGHuai-zhou3,ZHANGJuan2,WANGYan-xin2,FANGXiang2

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430065,China; 2.EncephalopathyCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 3.CollegeofClinicalChineseMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

ObjectiveTo study the effect of Gandouling on the miRNA-122 expression in liver tissues of rats with Wilson’s disease (WD) and to explore the action mechanism of Gandouling in liver protection.MethodsTwenty-four Wistar rats were randomly divided into blank control group, model group, penicillamine group, and Gandouling group. All rats except those in the blank control group were given copper-overloaded diets for 8 weeks. Then, the penicillamine group and Gandouling group

penicillamine and Gandouling, respectively, by gavage at human-equivalent doses, while the blank control group and model group received an equal volume of normal saline by gavage; intragastric administration was performed for 4 weeks in each group. The liver function and hepatic miRNA-122 expression in each group were measured.ResultsBoth Gandouling and penicillamine significantly reduced the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and total bilirubin (TBil) (P<0.05 orP<0.01), which were abnormally elevated in rats with WD, and significantly increased miRNA-122 expression (P<0.01), which was significantly reduced in the liver tissues of rats with WD. Gandouling was significantly superior to penicillamine in reducing serum ALT, AST, and TBil levels and increasing hepatic miRNA-122 expression (P<0.05 orP<0.01).ConclusionGandouling can protect the liver function of rats with WD, possibly by increasing hepatic miRNA-122 expression.

Wilson’s disease; Gandouling; penicillamine; miRNA-122

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202691)

沈斌(1980-)，男，博士研究生，主治醫(yī)師

鮑遠(yuǎn)程，1640748037@qq.com

R742.4；R285.5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.017

2014-06-07)