樸起范，郭長青，付偉濤，于佳妮，梁楚西，張麗萍，崔成俊

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029)

針刀療法對腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛大鼠血清IL-1和IL-6的影響

樸起范，郭長青，付偉濤，于佳妮，梁楚西，張麗萍，崔成俊

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029)

目的觀察針刀療法對腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛大鼠血清白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)含量的影響，探討針刀療法治療腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛的機(jī)制。方法將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、針刀組，每組10只。采用非壓迫性髓核突出模型，用熱痛測試儀檢測各組大鼠模型復(fù)制前后縮爪潛伏期；模型復(fù)制后第8天，采用雙抗夾心ELISA法檢測各組血清IL-1、IL-6含量。結(jié)果與正常組和假手術(shù)組比較，模型組縮爪潛伏期差值顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，針刀組縮爪潛伏期差值顯著降低(P<0.01)。與正常組比較，模型組血清IL-1、IL-6含量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，針刀組IL-1、IL-6含量明顯減少(P<0.01)。針刀組大鼠神經(jīng)根的髓鞘、軸突和雪旺細(xì)胞的病理變化較模型組明顯減輕。結(jié)論針刀療法減輕腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛的機(jī)制與其降低血清炎性細(xì)胞因子IL-1和IL-6有關(guān)。

針刀療法；腰椎間盤突出癥；根性神經(jīng)痛；IL-1；IL-6

腰椎間盤突出癥是常見病和多發(fā)病，對患者日常生活和工作造成嚴(yán)重影響。大量的臨床報道肯定了針刀治療腰椎間盤突出癥的療效[1-3]，但其作用機(jī)制仍處于假設(shè)和論證階段。本實(shí)驗(yàn)通過觀察腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛大鼠血清白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量的變化，探討針刀療法的外周鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料

1.1 動物與分組 清潔級SD雄性健康大鼠40只，體質(zhì)量(250±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2001-0001。于北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸機(jī)制實(shí)驗(yàn)室動物室中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將其隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、針刀組，每組各10只。

1.2 主要儀器 HZ系列一次性使用針刀(漢章針刀)：北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為0.4 mm×40 mm；28號一次性無菌針灸針：華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為0.35 mm×25 mm；骨科手術(shù)器械：含手術(shù)刀、剪、鑷和鉗；9號腰椎穿刺針：江蘇省揚(yáng)州市江洲醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；低溫離心機(jī)：德國Eppendorf公司，5810R型；MDF-U50A超低溫冰箱：日本SANYO公司；AE160電子天平：瑞士METTLER公司；Thermo Multiskan MK3：芬蘭。

1.3 主要試劑 大鼠IL-1、IL-6 ELISA測定試劑盒：北京瑞格博科技有限公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制方法 采用陸志東等[4]非壓迫性腰椎間盤髓核突出癥模型復(fù)制方法。

2.1.1 自體髓核混懸液的制備：術(shù)前1 d，大鼠背部用脫毛劑脫毛。10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉，無菌條件下距尾根部1 cm處切下鼠尾并縫合傷口。切開尾部椎間盤，見髓核呈膠凍樣約10 mg，取5個髓核，按1 mg加入1 μL生理鹽水配伍比例，充分?jǐn)嚢柘♂尦苫鞈乙簜溆谩?/p>

2.1.2 具體操作方法：模型組：將大鼠腰椎置于屈曲側(cè)臥位，以L4—5棘突間隙為穿刺點(diǎn)，用9號腰椎穿刺針行硬膜外穿刺，成功后注射20 μL大鼠自體髓核混懸液，接著將2%利多卡因30 μL注射到硬膜外腔。假手術(shù)組：麻醉、斷尾、硬膜外穿刺同模型組，不同的是將20 μL生理鹽水和2%利多卡因30 μL注射到硬膜外腔。針刀組復(fù)制方法同模型組。水合氯醛麻醉恢復(fù)后，大鼠四肢活動自如，說明硬膜外穿刺和注射失敗。雙前肢活動自如，雙后肢運(yùn)動、感覺喪失或減退，20～30 min后完全恢復(fù)，說明硬膜外穿刺注射成功。此時，可繼續(xù)進(jìn)一步觀察其雙下肢有無癱瘓(步態(tài)不穩(wěn)或足外翻)以判定模型復(fù)制過程中是否對脊髓有損傷。若無癱瘓，則對其兩側(cè)后足進(jìn)行熱刺激痛覺過敏的檢測，若熱痛反應(yīng)出現(xiàn)痛覺過敏，則提示模型復(fù)制成功。

2.2 干預(yù)方法 正常組正常飼養(yǎng)；假手術(shù)組和模型組均在模型復(fù)制后正常飼養(yǎng)。針刀組模型復(fù)制3 d后給予針刀干預(yù)。施針刀時首先用自制襪套將大鼠固定于鼠板上，以使其不能強(qiáng)烈掙扎為度。在L4—5棘間、L4—5棘間旁開0.1 cm處局部無菌操作，進(jìn)行針刀操作，以大鼠下肢觸電樣抽動為度。每周治療1次，共治療1次。

2.3 取材 模型復(fù)制后第8天將各組大鼠分別固定于鍘刀，在枕骨大孔水平斷頭處死。各組大鼠均采用斷頭后迅速倒置，離心管收集全血5 mL，4 ℃下靜置3 h，置于離心機(jī)內(nèi)離心(4 ℃，3 500 r/min，10 min)，離心后取上清，放于-20 ℃冰箱中保存待測。斷頭處死大鼠，采血后，從腹腔解剖入路暴露L5神經(jīng)根，取長約2 mm的神經(jīng)根組織，以10%甲醛浸泡固定，置于4 ℃冰箱中保存，以備切片觀察。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 一般情況：從模型復(fù)制第1天開始，觀察大鼠有無煩躁、撕咬肢體、頻繁搖動尾巴、后肢或足突然自發(fā)抬起、用嘴反復(fù)舔后爪、食欲降低等反應(yīng)。

2.4.2 后肢縮爪潛伏期的變化：后肢縮爪潛伏期的檢測均于下午(13:00—18:00)進(jìn)行，將各組大鼠置于PL-200型熱痛測試儀的檢測盒內(nèi)，輻射熱光源經(jīng)底部玻璃板聚焦到一側(cè)足底的后半部，光斑直徑5 mm。記錄從開始照射到產(chǎn)生縮爪的時間。每次測試間隔至少5 min，測量3次取平均值，兩側(cè)后足交替檢測，根據(jù)平均值求出兩后足的縮爪潛伏期，計算術(shù)前潛伏期與術(shù)后潛伏期的差值，差值顯著大于正常大鼠則表明潛伏期降低，對熱痛反應(yīng)存在痛覺過敏。

2.4.3 血清IL-1和IL-6檢測：采用雙抗夾心ELISA法檢測血清IL-1、IL-6，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.4.4 病理組織學(xué)觀察： 將各組大鼠長約2 mm的L5神經(jīng)根浸泡固定后，石蠟包埋，自神經(jīng)根分叉近端開始切片，切片厚度為5 μm，脫蠟，蘇木精-伊紅(hemotoxylin-eosin, HE)溶液染色。常規(guī)脫水，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)根的病理改變。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 本次模型復(fù)制全部成功。模型大鼠活動減少，精神萎靡，多蜷縮于籠中一角，飲食、飲水較正常減少。自由活動時，行走速度變慢，步幅和頻率減小，未出現(xiàn)撕咬肢體、頻繁搖動尾巴、后肢或足突然自發(fā)抬起、用嘴反復(fù)舔后爪、食欲降低，而出現(xiàn)了易激惹、活動頻繁的行為。

3.2 各組治療前后縮爪潛伏期差值比較 與正常組和假手術(shù)組比較，模型組縮爪潛伏期差值顯著增大(P<0.01)；與模型組比較，針刀組縮爪潛伏期差值顯著減小(P<0.01)。見表1。

3.3 各組大鼠血清IL-1、IL-6水平比較 與正常組比較，模型組血清IL-1、IL-6水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，針刀組血清IL-1、IL-6水平明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠縮爪潛伏期差值及血清IL-1和IL-6比較

注：與正常組比較，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

3.4 各組大鼠神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)變化 正常組、假手術(shù)組神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)致密、完整，有髓纖維的髓鞘完整、排列規(guī)則整齊，雪旺細(xì)胞大小均勻一致，數(shù)量較多，軸突表面規(guī)則完整，排列規(guī)則，無水腫。模型組有髓纖維的髓鞘不完整，排列不規(guī)則，雪旺細(xì)胞數(shù)量減少，軸突邊緣模糊，大小不規(guī)則，出現(xiàn)水腫變形，排列稀疏，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的空泡。針刀組出現(xiàn)新生的髓鞘，髓鞘整體排列規(guī)則，大小基本一致，軸突無水腫，排列整齊，雪旺細(xì)胞大小一致。見圖1。

注：A.正常組；B.假手術(shù)組；C.模型組；D.針刀組。

圖1各組大鼠右側(cè)L5神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，10×40倍)

4 討論

目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，根性神經(jīng)痛的發(fā)生與腰椎間盤突出引起的機(jī)械性壓迫因素及多種化學(xué)性炎性遞質(zhì)、免疫性炎性遞質(zhì)、細(xì)胞因子、神經(jīng)源性炎性遞質(zhì)有關(guān)[6]。突出的椎間盤組織壓迫神經(jīng)根或神經(jīng)根被牽伸是引起坐骨神經(jīng)痛的原因，但是許多患者髓核和神經(jīng)根之間的接觸并沒有機(jī)械壓迫，也有明顯的腰腿痛。本實(shí)驗(yàn)所建立的動物模型亦證實(shí)了這一點(diǎn)：將大鼠自體髓核移植到硬膜外腔，未出現(xiàn)運(yùn)動障礙，排除了機(jī)械壓迫因素后，大鼠活動頻繁，易激惹，模型組大鼠模型復(fù)制前后熱刺激縮爪潛伏期差值明顯高于正常組和假模型組(P<0.01)，后肢出現(xiàn)明顯的痛覺過敏反應(yīng)，說明病理情況下髓核本身也能引起坐骨神經(jīng)痛。組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示模型大鼠有髓神經(jīng)纖維出現(xiàn)脫髓鞘改變、空泡樣變性等病理改變，表明髓核本身的自身免疫炎性反應(yīng)是引起根性神經(jīng)痛的可能因素之一。

IL-1是一種細(xì)胞因子，屬于白細(xì)胞介素的一種。白細(xì)胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎性反應(yīng)中起重要作用。腰椎間盤組織是人體最大的無血供組織，髓核被纖維環(huán)包裹與血液循環(huán)相隔離。當(dāng)外傷或退行性病變導(dǎo)致椎間盤抗原成分與血液循環(huán)相接觸后，能產(chǎn)生免疫反應(yīng)[6]，釋放多種炎性遞質(zhì)。近年來的研究證實(shí)了突出的髓核組織可以產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和IL-1β[7]，細(xì)胞因子和神經(jīng)疼痛的關(guān)系因此受到了廣泛的關(guān)注。Inoue A等[8]發(fā)現(xiàn)IL-1β通過促進(jìn)背側(cè)脊神經(jīng)節(jié)釋放P物質(zhì)，傳遞初級傳入神經(jīng)的有害刺激信號，降低疼痛的閾值，從而造成痛覺過敏。暴露髓核的存在導(dǎo)致了各種生物化學(xué)因子的產(chǎn)生并通過各種途徑引起鄰近神經(jīng)根的損傷和產(chǎn)生疼痛，這些因子間的相互作用及其在腰椎間盤突出癥中具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。Wehling等[9]采用IL-1受體拮抗劑能顯著減輕脊神經(jīng)根的過敏性炎性損傷，說明IL-1在神經(jīng)根損傷中也起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠活動頻繁，易激惹，后肢出現(xiàn)明顯的痛覺過敏反應(yīng)，正是脊神經(jīng)節(jié)受到有害刺激和損傷的表現(xiàn)。血清中IL-1的含量明顯升高(P<0.01)，表明模型復(fù)制后由于髓核的免疫炎性反應(yīng)促使機(jī)體釋放IL-1等物質(zhì)，引起了機(jī)體的痛覺過敏和痛反應(yīng)。針刀干預(yù)后，血清中IL-1含量均較模型組顯著降低(P<0.01)，說明針刀干預(yù)后，可減少外周IL-1的釋放，減輕模型鼠的疼痛。這提示針刀療法能顯著改善腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛的炎性反應(yīng)，這為臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

IL-6是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，也是機(jī)體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，它可以調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的作用[10]。有研究表明，IL-6的血濃度與患者感染的嚴(yán)重程度以及炎性反應(yīng)的程度呈正相關(guān)，可作為判斷病情嚴(yán)重程度的靈敏指標(biāo)[11-12]。IL-6在正常情況下調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。IL-6不能刺激相應(yīng)細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子，在生理濃度下對免疫細(xì)胞的自分泌作用亦比較弱，提示其主要免疫學(xué)功能是加強(qiáng)其他細(xì)胞因子的效果，而在病理狀態(tài)下，其濃度的升高可引起免疫性的病理損傷[13]。IL-6是敏感反映機(jī)體炎癥和組織損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[14]。IL-6是一種在損傷后協(xié)調(diào)系統(tǒng)性宿主防御反應(yīng)中起重要作用的細(xì)胞因子，多在細(xì)胞受到TNF-α、IL-1β刺激后產(chǎn)生，本身對細(xì)胞無直接損害作用，能促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化、聚集，與多種疾病的病理生理過程緊密相關(guān)，血清IL-6水平可反映組織損傷程度[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-6的含量較正常組顯著升高(P<0.01)，針刀干預(yù)后，血清IL-6含量均較模型組顯著降低(P<0.05)。結(jié)果提示髓核與血液循環(huán)接觸后，產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，并釋放了炎性遞質(zhì)，也說明針刀干預(yù)后，可減少外周IL-6的釋放，減輕模型大鼠的炎性反應(yīng)。

針刀療法將針刺療法和手術(shù)松解法有機(jī)地結(jié)合為一體[16]，一方面利用針刺的作用，疏通氣血、活血化瘀，“通則不痛”；另一方面利用刀的切割作用，松解粘連，解除卡壓，“以松致通，通則不痛”。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)針刀療法可直接作用于腰椎間盤突出癥大鼠的病變局部，松解局部黏連和攣縮，改善局部血液循環(huán)，并通過調(diào)節(jié)血清IL-1和IL-6含量，從而減輕髓核所致的外周炎性反應(yīng)對機(jī)體的傷害性感受器的刺激作用，這可能是針刀療法治療腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛的外周鎮(zhèn)痛機(jī)制之一。

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EffectofAcupotomyonSerumInterleukin-1andInterleukin-6LevelsinRatswithRadicularPainDuetoLumbarDiscHerniation

PIAOQi-fan,GUOChang-qing,FUWei-tao,YUJia-ni,LIANGChu-xi,ZHANGLi-ping,CUICheng-jun

(SchoolofAcupunctureandMoxibustion,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

ObjectiveTo observe the effect of acupotomy on serum interleukin-1 (IL-1) and interleukin-6 (IL-6) levels in rats with discogenic radiculagia and to explore the possible mechanism of acupotomy in treating this disease.MethodsForty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, sham-operation group, model group, and acupotomy group, with 10 rats in each group. A rat model of non-compressive nucleus pulposus protrusion was induced. A thermal pain tester was used to measure the hindpaw withdrawal latency (HWL) of each rat before and after the model was induced. On the 8th day after the model was induced, double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine serum IL-1 and IL-6 levels in each group.ResultsCompared with the normal group and sham-operation group, the model group had a significantly increased difference value of HWL (P<0.01); compared with the model group, the acupotomy group had a significantly reduced difference value of HWL (P<0.01). Compared with the normal group, the model group had significantly increased serum IL-1 and IL-6 levels (P<0.01); compared with the model group, the acupotomy group had significantly reduced serum IL-1 and IL-6 levels (P<0.01). Compared with the model group, the acupotomy group had ameliorated pathological changes in the myelin sheath, axon, and Schwann cells.ConclusionThe mechanism by which acupotomy relieves radicular pain due to lumbar disc herniation may involve reducing serum IL-1 and IL-6 levels.

acupotomy; lumbar disc herniation; radicular pain; interleukin-1; interleukin-6

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題項目(0100605128)

樸起范(1987-)，男，碩士研究生

郭長青，guochangqing66@163.com

R681.5+5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.015

2014-06-26)