胡 靜，李 欣，閻曉濤，任永康 ，郭慧娟 ，詹海仙 ，喬麟軼 ，暢志堅(jiān) ，張曉軍

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032）

中間偃麥草（Thinopyrum intermedium amphiploid，2n＝6x＝42，EEEEXX或 JJsSt）為禾本科小麥亞族（Triticinae）多年生野生草本植物，是普通小麥（Triticum aestivum，2n＝6x＝42，AABBDD） 的近緣物種之一[1-3]，免疫小麥葉銹、條銹、稈銹、白粉等病害[4]，高抗小麥黃矮病、黑穗病、葉枯病和根腐病等，且有較強(qiáng)的耐鹽堿、耐旱和耐低溫性，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，再生性好，適應(yīng)性廣等特性。目前，其已成為小麥遺傳改良中具有重要利用價(jià)值的野生親本之一[4]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已將多個(gè)偃麥草的有益基因轉(zhuǎn)移到普通小麥中[5-8]。

本試驗(yàn)以來(lái)源于中間偃麥草的八倍體小偃麥TAI7047（2n＝8x＝56）為橋梁親本，從其與普通小麥晉太170雜交、回交的BC1F6選系中選育出一個(gè)高抗稈銹病、白粉病的小麥-中間偃麥草異代換系CH08-141。2011—2012年，分別在四川邛崍電子科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽(yáng)試驗(yàn)基地溫室進(jìn)行了稈銹病和白粉病的接種鑒定。為了明確抗病新種質(zhì)CH08-141中所攜帶的抗病基因來(lái)源及其所在的染色體位置，進(jìn)一步利用基因組原位雜交和SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了分析鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

八倍體小偃麥TAI7047為暢志堅(jiān)[9]利用遠(yuǎn)緣雜交方法選育出的高抗小麥稈銹病、白粉病的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體。晉太170為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所選育的優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種[10]。CH08-141為八倍體小偃麥TAI7047與普通小麥晉太170雜交、回交的BC1F6選系中選育出的高抗稈銹病、白粉病的高代品系?？共¤b定所用病理小種稈銹Ug99和白粉菌E09來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保研究所，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保存繁殖。

1.2 方法

1.2.1 抗病性鑒定 為分析CH08-141的抗病特性及其所攜帶的抗病基因來(lái)源，于2011—2012年，分別在四川省邛崍市電子科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)對(duì)CH08-141及其雜交親本TAI7047、晉太170和TAI7047的親本中間偃麥草、晉春5號(hào)接種目前我國(guó)流行的稈銹菌小種Ug99，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽(yáng)試驗(yàn)基地溫室接種白粉菌小種E09進(jìn)行抗病鑒定，使用高感品種SY95-71作為感病對(duì)照及誘發(fā)材料。接種15～18 d后，當(dāng)感病品種充分發(fā)病時(shí)，按 0（免疫）、0；（過(guò)敏性壞死）、1（高抗）、2（中抗）、3（中感）和4（高感）的6級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別調(diào)查、記載其稈銹病和白粉病的侵染型，其中，0～2的侵染型為抗病，3～4的侵染型為感病。

1.2.2 根尖細(xì)胞中期染色體制備 根尖細(xì)胞中期染色體制備、探針標(biāo)記及原位雜交程序參照Han等[11-12]描述的方法進(jìn)行。

將CH08-141種子放到吸滿水的濾紙上，置于培養(yǎng)皿中，24℃進(jìn)行發(fā)根；當(dāng)根尖長(zhǎng)到1.0～1.5 cm時(shí)，剪取根尖端0.5 cm，放入打孔并噴了水的1.5 mL離心管中，室溫下使用N2O處理2 h；然后用90%冰乙酸固定10 min，再用蒸餾水沖洗3次，待無(wú)明顯乙酸味時(shí)置入70%乙醇中保存?zhèn)溆?。將纖維素酶與果膠酶按一定比例混合均勻，取1 mL混合酶液放入0.5 mL離心管中，在37℃恒溫保濕箱中預(yù)熱5 min；將用蒸餾水洗凈的根尖放入混合酶液中，保持37℃處理50 min；將多余酶液吸出，用蒸餾水將根尖沖洗3次，然后加入20μL 1×TE溶液，用鑷子將根尖擠碎并混勻；用移液器吸取20μL細(xì)胞懸混液，于載玻片上方10 cm處滴片；晾干后在顯微鏡下觀察染色體的分散效果。

1.2.3 基因組原位雜交（GISH） 基因組DNA的提取采用CTAB法[13]。以Chroma Tide Alexa Fluor 488-5-dUTP1標(biāo)記的中間偃麥草基因組DNA作探針，以中國(guó)春基因組DNA作封阻，對(duì)CH08-141的根尖細(xì)胞中期染色體進(jìn)行基因組原位雜交分析。

選取分散均勻、染色體數(shù)目完整的制片放入紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)；每個(gè)制片滴加稀釋好的探針（以2×SSC和 1×TE溶液稀釋到 20 ng/μL）6μL；蓋上塑料蓋玻片，放入鐵盤，在100℃沸水中處理5 min，再放入55℃恒溫保濕箱中雜交過(guò)夜；雜交好的制片使用2×SSC溶液沖洗2次，晾干后滴1滴DAPI（4，6-diamidino-2-phenylindole），蓋上玻璃蓋玻片；在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 SSR標(biāo)記分析 選取48對(duì)平均分布于小麥基因組染色體上的小麥特有SSR引物，覆蓋小麥全部基因組ABD染色體，每條染色體上長(zhǎng)、短臂各選取2對(duì)引物，以晉太170、中國(guó)春、TAI7047、晉春5號(hào)、中間偃麥草為對(duì)照，對(duì)CH08-141進(jìn)行分子標(biāo)記的染色體定位，從而判定CH08-141中被代換染色體所屬小麥基因組。

2 結(jié)果與分析

2.1 CH08-141抗病性分析

以SY95-71作為感病對(duì)照，用稈銹菌小種Ug99和白粉菌小種E09對(duì)CH08-141及其親本進(jìn)行抗病性鑒定。結(jié)果表明，CH08-141對(duì)這2個(gè)小種均表現(xiàn)高抗（表1）。

表1 CH08-141、八倍體小偃麥TAI7047及其親本對(duì)白粉病和稈銹病的抗性表現(xiàn)

通過(guò)對(duì)其雜交親本TAI7047、晉太 170及TAI7047的親本中間偃麥草和晉春5號(hào)抗病鑒定結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果（表1）顯示，中間偃麥草對(duì)Ug99和E09均表現(xiàn)免疫，其侵染型為0級(jí)；CH08-141和TAI7047表現(xiàn)為近免疫，其侵染型為0；級(jí)；而CH08-141和TAI7047的小麥親本晉太170和晉春5號(hào)均高感稈銹病和白粉病，其侵染型為4級(jí)。因此，推測(cè)CH08-141對(duì)稈銹病和白粉病的抗病基因可能來(lái)源于八倍體小偃麥及其野生親本中間偃麥草。

2.2 GISH結(jié)果分析

CH08-141是利用優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥新品種晉太170與來(lái)源于中間偃麥草的八倍體小偃麥TAI7047通過(guò)回交轉(zhuǎn)育法選育的高抗小麥稈銹病、白粉病的小麥新種質(zhì)，其自交后代表現(xiàn)穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)性狀分離的情況；不同單株種子進(jìn)行根尖有絲分裂中期檢測(cè)結(jié)果顯示，其染色體數(shù)目均為2n＝42，與普通小麥相同。

以Chroma Tide Alexa Fluor 488-5-dUTP1標(biāo)記的中間偃麥草DNA作探針、中國(guó)春基因組DNA作封阻的原位雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每個(gè)細(xì)胞分裂相中均有1對(duì)染色體被激發(fā)出綠色熒光（圖1），表明CH08-141中有1對(duì)染色體被中間偃麥草染色體所代換。

2.3 SSR標(biāo)記結(jié)果分析

使用平均分布于小麥基因組ABD染色體上的48對(duì)SSR引物對(duì)CH08-141及其親本TAI7047和晉太170以及TAI7047的親本中間偃麥草和晉春5號(hào)進(jìn)行小麥特異標(biāo)記鑒定，結(jié)果顯示，位于小麥染色體6BS上的GWM508和位于小麥染色體6BL上的GWM219，WMC494表現(xiàn)出明顯差異，對(duì)照品種中國(guó)春、小麥親本晉太170、晉春5號(hào)及TAI7047都擴(kuò)增出其特有帶型，而CH08-141、中間偃麥草則表現(xiàn)為帶型缺失（圖2）；位于小麥其他染色體上的SSR引物擴(kuò)增結(jié)果均表現(xiàn)為：CH08-141、對(duì)照品種中國(guó)春、小麥親本晉太170、晉春5號(hào)及TAI7047都擴(kuò)增出其特有帶型，而中間偃麥草則表現(xiàn)為帶型缺失。因此，初步判定CH08-141中被代換的染色體屬于小麥B基因組第6同源群，即6B染色體。更加準(zhǔn)確的結(jié)果還有待于進(jìn)一步深入分析。

3 討論

八倍體小偃麥?zhǔn)侨藗冊(cè)诶觅塞湶菖c普通小麥進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中人工選育的一種植物新物種，除含有普通小麥完整的42條染色體外，還包含來(lái)源于偃麥草的14條染色體，保留了偃麥草的許多優(yōu)良性狀，因其與普通小麥染色體組成相近，可以有效克服遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中極易出現(xiàn)的染色體不親和現(xiàn)象，因此，成為普通小麥利用外源基因進(jìn)行遺傳改良的重要途徑之一。TAI7047為暢志堅(jiān)[9]選育的八倍體小偃麥新類型，具有抗條銹、葉銹、稈銹病及優(yōu)質(zhì)、多年生等優(yōu)良特性，是偃麥草有用基因向小麥轉(zhuǎn)移的重要橋梁材料。

CH08-141高抗稈銹病、白粉病，兼具雙親的優(yōu)良農(nóng)藝性狀，是一個(gè)新型的小麥種質(zhì)系。由于其小麥親本晉太170高感稈銹病和白粉病，而TAI7047及其野生親本中間偃麥草對(duì)稈銹病和白粉病表現(xiàn)免疫，因此，推測(cè)CH08-141對(duì)稈銹病和白粉病的抗病基因可能來(lái)自TAI7047，抗病基因也可能位于它們含有的偃麥草染色體上[14]。中間偃麥草的J或Js組染色體攜帶有抗白粉病及稈銹病基因[15]，它與普通小麥雜交選育的后代如果含有J或Js組染色體，那么這個(gè)材料也就攜帶有此抗病基因。根據(jù)暢志堅(jiān)[9]對(duì)八倍體小偃麥TAI7047的GISH分析，其外源基因組由1對(duì)S組染色體、1對(duì)S組與J組的中間易位染色體和6對(duì)J組染色體組成，未發(fā)現(xiàn)有Js組染色體存在。因此，推測(cè)CH08-141很可能是由中間偃麥草的J組染色體代換了小麥的6B染色體所形成的異代換系，其所含有的外源染色體對(duì)被代換的小麥染色體在功能上具有良好的補(bǔ)償作用[16]，不僅能夠保持小麥高產(chǎn)、高效的特點(diǎn)，還具有偃麥草的某些優(yōu)良性狀，在小麥抗病育種及遺傳改良中具有重要的意義。

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