王婷，崔新潔，劉秉春，陶琳，胡慶亮，修磊，王瀟

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

牛白細(xì)胞介素-17真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

王婷，崔新潔，劉秉春，陶琳，胡慶亮，修磊，王瀟

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

【目的】在體外分離培養(yǎng)牛乳腺上皮原代細(xì)胞，并構(gòu)建牛白細(xì)胞介素-17(bIL-17)基因真核表達(dá)質(zhì)粒，觀察重組質(zhì)粒在牛乳腺上皮細(xì)胞的表達(dá).【方法】提取牛脾臟細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增bIL-17，將bIL-17連入pMD19-T進(jìn)行測序，測序成功后將bIL-17插入含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3上，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂質(zhì)體法將pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于牛乳腺上皮細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，RT-PCR檢測bIL-17基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，定量ELISA檢測bIL-17蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況.【結(jié)果和結(jié)論】成功構(gòu)建具有綠色熒光和新霉素抗性的雙選擇標(biāo)記的牛白細(xì)胞介素-17真核表達(dá)載體，并可在牛乳腺上皮細(xì)胞成功表達(dá).

牛白細(xì)胞介素- 17;載體構(gòu)建;牛乳腺上皮細(xì)胞;轉(zhuǎn)染;表達(dá)

奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎是影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一［1］.金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus造成乳房持續(xù)性感染的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳腺持續(xù)感染與奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌炎性因子能力不足，從而無法招募足夠的中性粒細(xì)胞到達(dá)炎性部位而清除病原細(xì)菌有關(guān)［2］.乳腺上皮細(xì)胞作為泌乳的功能性細(xì)胞，是病原菌進(jìn)入乳腺后首先接觸的細(xì)胞，對病原微生物的識別顯得尤為重要，同時(shí)對乳腺的先天性免疫起到促進(jìn)作用.故體外如何增強(qiáng)牛乳腺上皮細(xì)胞分泌炎性因子能力是解決乳腺持續(xù)感染的關(guān)鍵所在［3］.

牛白細(xì)胞介素-17(IL-17)由CD4+T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌，最初被命名為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原8(CTLA-8)，是一種促炎性細(xì)胞因子［4］.研究發(fā)現(xiàn)IL-17存在6個(gè)家族成員(IL-17A、IL-17 B、IL-17 C、IL-17D、IL-17E、IL-17F)，目前對于IL-17A研究最為廣泛，一般所說的IL-17即為IL-17A［5］.現(xiàn)已表明，IL-17A具有強(qiáng)大的招募激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的作用，IL-17可以誘導(dǎo)趨化性細(xì)胞因子如IL-8、單核細(xì)胞趨化因子21(MCP21)和GRO2-α的表達(dá)增高;IL-17還能夠誘導(dǎo)刺激機(jī)體分泌IL-1、IL-6、TNF-α等多種炎癥因子，在細(xì)菌、真菌、病毒等所致的感染性疾病中起著重要的抗感染作用［6-7］.已有試驗(yàn)表明，重組IL-17在體外可刺激乳腺上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)乳腺上皮細(xì)胞的抗感染能力［8］.

本研究用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)克隆牛IL-17cDNA，構(gòu)建具有綠色熒光和新霉素抗性的雙選擇標(biāo)記真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并在牛乳腺上皮細(xì)胞中得以表達(dá)，為后續(xù)奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎基因防治以及抗病轉(zhuǎn)基因奶牛的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物組織與細(xì)胞培養(yǎng)

牛脾臟取自呼和浩特北亞清真屠宰場.牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)采用從乳汁中分離乳腺上皮細(xì)胞的方法，新鮮牛奶取自內(nèi)蒙古呼和浩特市小黑河鎮(zhèn)二道河村奶農(nóng)飼養(yǎng)的日產(chǎn)奶量40 kg的荷斯坦奶牛，取奶時(shí)間是產(chǎn)后2～4個(gè)月常乳.

1.2 主要試劑及儀器

PrimeScript RT reagent Kit、TaqTM、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraciong Kit Ver 3.0為TaKaRa公司產(chǎn)品;TIANprep Mini Plasmid Kit為TIANGEN公司產(chǎn)品;EcoRⅠ、SalⅠ、pMD19-T vector、T4 DNA Ligase為 TaKaRa公司產(chǎn)品;pEGFP-N3 vector及DH5α感受態(tài)大腸埃希菌Escherichia coli菌株由內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室保存;牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)試劑：完全培養(yǎng)液成分是FBS(體積分?jǐn)?shù)為10%)+DMEM/F12+100 U雙抗+氫化考的松(1 μg/mL)+孕酮(1 μg/mL)+轉(zhuǎn)鐵蛋白(5 μg/mL)+胰島素(5 μg/mL)+L-谷氨酰胺(292 μg/mL)+EGF (10 ng/mL)，其中FBS、EGF、DMEM/F12為Hyclone公司產(chǎn)品，其余添加因子均為Sigma公司產(chǎn)品;卡那霉素為北京索萊寶生物有限公司產(chǎn)品;兔抗人的熒光單克隆抗體keratin 8為北京萊茲生物公司產(chǎn)品; LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品;mIL-17定量ELISA試劑為eBioscience公司產(chǎn)品.

1.3 bIL-17基因引物設(shè)計(jì)

從GenBank中查找下載牛的bIL-17基因序列，由MEGA 4.0分析軟件對序列進(jìn)行分析，閱讀其框架，選取具有功能的540 bp片段，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)1對引物：上游引物5'-GCGAATTCCTCACAGCGAGCACAAGT-3';下游引物5'-CCCTCGAGTAGGGGTCAGGCAGAAAG-3'，分別在上下游引物中設(shè)計(jì)了EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn).

1.4 bIL-17基因克隆

根據(jù)RNAiso Plus試劑盒說明，從牛脾臟提取組織總RNA.按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)合成cDNA第1鏈，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，加入5 μL10×Reaction buffer，4 μL dNTP混合物(2.5 mmol/L)，1 μL Pyrobest DNA聚合酶(2 U/μL)，上、下游引物各1 μL，加ddH2O至總體積50 μL.循環(huán)條件：94℃5 min;94℃30 s、64℃30 s、72℃30 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min.10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并按回收試劑盒說明對產(chǎn)物純化回收.

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和鑒定

將純化的PCR產(chǎn)物連于pMD19-T vector：pMD19-T vector 1 μL、純化bIL-17 4 μL、SolutionⅠ5 μL，16℃條件下反應(yīng)2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃條件下培養(yǎng)過夜，挑取轉(zhuǎn)化生長的陽性菌落，應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，對其進(jìn)行鑒定.將鑒定含有陽性質(zhì)粒的菌液送往上海生物工程公司進(jìn)行序列測定.

1.6 pEGFP-N3-bIL-17重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pMD19-T-bIL-17質(zhì)粒，回收bIL-17片段，將回收片段定向插入用同法酶切的pEGFP-N3載體啟動(dòng)子下游，得到重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17，構(gòu)建過程見圖1.

圖1 pEGFP-N3-bIL-17構(gòu)建示意圖Fig.1 The schematic diagram of pEGFP-N3-bIL-17 plasmid construction

1.7 pEGFP-N3-bIL-17重組真核表達(dá)載體的鑒定

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coliDH5α，卡那霉素篩選陽性克隆，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR及EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確后將菌液送至上海生物工程公司進(jìn)一步測序鑒定.

1.8 乳汁中乳腺上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

用無菌水清洗牛乳房，乙醇消毒后，手?jǐn)D牛乳于滅菌的藍(lán)蓋瓶中，放于盛有37℃溫水的保溫盒中帶回實(shí)驗(yàn)室.將200 mL乳汁與含雙抗的PBS按體積比2∶1混合后，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 500 r/min離心20 min，小心吸取細(xì)胞層，加入5 mL完全培養(yǎng)液，接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換液，之后每3 d換1次液，待細(xì)胞長出單克隆后原瓶消化，待長至80%匯集時(shí)傳代培養(yǎng)，凍存第3代細(xì)胞.

1.9 牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定

采用免疫組化方法檢測培養(yǎng)的細(xì)胞角蛋白8的表達(dá)：將細(xì)胞復(fù)蘇后，于常溫下用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定生長于24孔板中的細(xì)胞30 min，PBS清洗3次，每次5 min;加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的TritonX-100通透處理5 min，PBS清洗3次，每次5 min;加入PBS稀釋10倍的正常山羊血清封閉處理30 min;加兔抗人的細(xì)胞角蛋白8多克隆抗體(體積比1∶100稀釋)于37℃條件下振蕩孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min;加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG (體積比1∶50稀釋)，室溫下避光振蕩孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min;加入DAPI使用液(10 μg/mL)，室溫避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，同時(shí)以牛成纖維細(xì)胞作陰性對照.

1.10 真核表達(dá)載體pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞

將pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，取菌液50 μL接種到50 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上振蕩過夜.按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書方法提取并純化質(zhì)粒DNA.將凍存的乳腺上皮細(xì)胞復(fù)蘇到6孔板中，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度為70%時(shí)，用DMEM-F-12培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行6 h饑餓處理.處理后，將4 μg重組質(zhì)粒、5 μL PLUSTM Reagents加入到500 μL DMEM-F-12培養(yǎng)基中輕輕混勻，室溫靜置5 min后加入8 μL LipofectamineLTX，輕輕混勻并室溫靜置30 min.用PBS洗孔板中細(xì)胞，每孔加2 mL，洗3次，將轉(zhuǎn)染液加入到6孔板中，細(xì)胞放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱孵育6 h，去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物并加入含F(xiàn)BS(體積分?jǐn)?shù)為10%)的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)24～48 h，在488 nm波長激發(fā)光下，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況.

1.11 RT-PCR法檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞后bIL-17基因的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的乳腺上皮細(xì)胞(1.5×106個(gè)/mL)，按RNAiso Plus試劑法提取組織總RNA，并以它為模板進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增bIL-17，其方法同1.4.

1.12 定量ELISA法檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞后bIL-17基因的表達(dá)

根據(jù)IL-17定量ELISA試劑盒說明書進(jìn)行.用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定樣品中bIL-17表達(dá)水平.設(shè)置4組，分別為IL-17標(biāo)準(zhǔn)品組、牛乳腺上皮細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒組.用IL-17一抗包被96孔板，4℃條件下過夜孵育后，緩沖液洗板;使用緩沖液倍比稀釋IL-17A標(biāo)準(zhǔn)品，加入96孔板，每孔100 μL，剩余3組收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，12 000 r/min離心40 min，每孔加入100 μL上清液，4℃條件下過夜孵育后洗板;加入IL-17二抗，室溫孵育1 h后洗板;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的生物素(Avidin-HRP*)室溫孵育30 min后洗板;加入顯色劑室溫孵育15 min后洗板;最后加入終止液，室溫孵育15 min;酶標(biāo)儀檢測各孔D450nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算bIL-17基因的蛋白表達(dá)量.最后通過t檢驗(yàn)方法分析轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表達(dá)IL-17蛋白的差異.

2 結(jié)果

2.1 bIL-17基因片段擴(kuò)增

用所設(shè)計(jì)的引物，從牛脾臟中擴(kuò)增出大約為540 bp基因片段，其與預(yù)期目的片段大小相符，結(jié)果如圖2所示.

圖2 bL-17基因的RT-PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of bovine IL-17 gene amplified by RT-PCR

2.2 bIL-17基因片段與pMD19-T質(zhì)粒連接和重組質(zhì)粒的鑒定

純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶與pMD19-T質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，隨機(jī)挑選出陽性重組菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，用PCR法擴(kuò)增出約540 bp的bIL-17基因片段;同樣用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒也可分離到540 bp的基因片段和開環(huán)質(zhì)粒pMD19-T，結(jié)果見圖3a.測序及Blast分析顯示與GenBank中的序列完全相同(登錄號：NM_018865)，測序結(jié)果圖略.

2.3 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17酶切鑒定

純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶與pEGFPN3質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，隨機(jī)挑選出陽性重組子菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，用PCR法擴(kuò)增出約540 bp的bIL-17基因片段;同樣用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒也可分離到540 bp的基因片段和開環(huán)質(zhì)粒pEGFP-N3(4.7 kb)，測序及Blast分析顯示bIL-17基因已經(jīng)成功插入到pEGFP-N3載體.結(jié)果見圖3b.

2.4 牛奶中乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

新鮮牛奶離心獲得的細(xì)胞接種3 d后，均可見許多鵝卵石樣細(xì)胞聚集生長形成的克隆，以及分散生長的呈梭形的單個(gè)細(xì)胞，同時(shí)還可見少量的吞噬細(xì)胞(圖4A、4B);每3 d換液，繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，形成許多大的、生長均勻的單細(xì)胞克隆，呈現(xiàn)鵝卵石狀和多角形2種形態(tài)(圖4C、4D)，在細(xì)胞克隆的表面可觀察到分泌到胞外的乳滴(圖4E)，同時(shí)觀察到大量吞噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移到乳滴中(圖4F).原瓶消化使細(xì)胞分散，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，細(xì)胞在瓶底80%匯集，吞噬細(xì)胞消失，形成均勻的多角形和鵝卵石狀細(xì)胞混合生長的乳腺上皮細(xì)胞層(圖4G).細(xì)胞傳至第3代時(shí)將其凍存，復(fù)蘇后存活率高達(dá)90%，如圖4H所示.

圖3 pMD19-T-bIL-17(a)、pEGFP-N3-bIL-17(b)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid pMD19-T-bIL-17(a)and pEGFP-N3-bIL-17(b)digested by double-enzyme cleavage methed

圖4 乳汁中分離培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)(100×)Fig.4 The picture of the cultured bovine mammary epithelial cells from milk(100×)

2.5 原代牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定

應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞染色法檢測純化牛乳腺上皮細(xì)胞的骨架蛋白——角蛋白8的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，從牛乳中分離培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞角蛋白8表達(dá)呈陽性(圖5).圖中綠色熒光為表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中的角蛋白8，藍(lán)色部分為DAPI染色的細(xì)胞核，進(jìn)一步在蛋白水平上證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞是乳腺上皮來源.

圖5 免疫熒光細(xì)胞染色鑒定角蛋白8表達(dá)(100×)Fig.5 Keratin 8 expression identified by the immunohistochemistry assay(100×)

2.6 真核表達(dá)載體pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞

重組pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下觀察到約20%的細(xì)胞有梭形或圓形的綠色熒光(圖6)，證實(shí)重組質(zhì)粒pEGFPN3-bIL-17能有效轉(zhuǎn)染至牛乳腺上皮細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá).

2.7 RT-PCR鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17在牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞48 h后，采用RT-PCR方法對外源bIL-17基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定，結(jié)果(圖7)顯示，重組質(zhì)粒pEGFPN3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞組在約540 bp處出現(xiàn)bIL-17基因目的條帶，而未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組都沒有檢測到bIL-17基因目的條帶，證實(shí)重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，外源bIL-17基因可以獲得很好地轉(zhuǎn)錄.

圖6 熒光顯微鏡下觀察pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞(100×)Fig.6 Detection of GFP expression in bovine mammary epithelial cells by fluorescence microscope(100×)

圖7 RT-PCR檢測bIL-17基因在轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.7 The bIL-17 expression in the transfected bovine mammary epithelial cells detected by RT-PCR

2.8 真核載體pEGFP-N3-bIL17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞后bIL-17蛋白表達(dá)水平ELISA檢測結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞后bIL-17基因是否表達(dá)，我們應(yīng)用定量ELISA的方法對轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N3-bIL-17的牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液上清中bIL-17蛋白量進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖8所示，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-bIL-17質(zhì)粒牛乳腺上皮細(xì)胞組bIL-17蛋白含量高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞組(t-檢驗(yàn)，P＜0.05)，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒組bIL-17蛋白含量與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組基本無差異.

圖8 ELISA法檢測bIL-17基因在轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量Fig.8 The protein expression of bIL-17 in the transfected bovine mammary epithelial cells detected by ELISA

3 討論

乳腺上皮細(xì)胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能，體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為一種模型，既可用來研究乳蛋白基因表達(dá)［9］，又可作為乳腺特異性表達(dá)載體的檢測系統(tǒng)［10］，因此被廣泛應(yīng)用于乳蛋白基因表達(dá)及調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)學(xué)及乳腺生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)理論研究.另外，在乳腺炎的發(fā)病過程中，乳腺上皮細(xì)胞是病原菌在穿過乳頭末端的機(jī)械屏障后進(jìn)入機(jī)體內(nèi)部之前最先接觸的細(xì)胞，多種病原菌侵入乳腺后可通過各種方式黏附和侵入牛乳腺上皮細(xì)胞，因此，乳腺上皮細(xì)胞亦是體外研究乳腺炎發(fā)病機(jī)制和動(dòng)物基因治療的理想模型［11-14］，此外，牛乳中乳腺上皮細(xì)胞來源廣泛，易于取材，可以分離培養(yǎng)，易于接受外源基因尤其是質(zhì)粒DNA，并能穩(wěn)定表達(dá)對應(yīng)的基因產(chǎn)物，因此在動(dòng)物基因治療方面亦有良好的應(yīng)用前景.IL-17由CD4+T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞，單核細(xì)胞等分泌，最初被命名為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原8(CTLA-8)，是一種促炎性細(xì)胞因子.有研究顯示hIL-17可以刺激表皮成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞分泌IL-6和IL-8［15］.大量證據(jù)表明，IL-17具有強(qiáng)大的促炎作用和抗感染作用.在防御革蘭陰性細(xì)菌如肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae及脆弱類桿菌Bacterookdes fragilis等的感染中，可在感染早期募集中性粒細(xì)胞，通過刺激上皮細(xì)胞分泌IL-8、G-CSF等細(xì)胞因子誘導(dǎo)刺激樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的成熟分化，從而加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)機(jī)體清除細(xì)胞外感染的細(xì)菌，防止慢性感染和組織化膿發(fā)生［16-18］.IL-17還通過刺激IL-6和PGE2的產(chǎn)生，加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附因子(ICAM)產(chǎn)生，協(xié)同促進(jìn)T細(xì)胞反應(yīng)［19］，從而在非特異性免疫和特異性免疫之間建立聯(lián)系.因此，對IL-17在乳腺炎發(fā)病中作用的深入研究，可能為解決乳腺炎發(fā)病機(jī)制尚未解決的問題帶來新的希望.

本研究采用RT-PCR方法從牛脾臟中擴(kuò)增獲得牛IL-17基因編碼序列，并將其插入到真核表達(dá)載體pEGFP-N3中.用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞，獲得良好的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染pEGFPN3-bIL-17之后可以檢測到外源IL-17獲得了高效表達(dá).以牛乳腺上皮細(xì)胞作為靶細(xì)胞結(jié)合IL-17基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的進(jìn)一步研究，可能為后續(xù)奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎基因防治以及抗病轉(zhuǎn)基因奶牛的研究奠定基礎(chǔ).

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【責(zé)任編輯李曉卉】

Construction of bovine interleukin-17 eukaryotic expression vector and its expression in the bovine primary mammary epithelial cells

WANG Ting，CUI Xinjie，LIU Bingchun，TAO Lin，HU Qingliang，XIU Lei，WANG Xiao
(College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Hohhot 010021，China)

【Objective】To construct bovine interleukin-17(bIL-17)gene eukaryotic expression vector and detect its expression in bovine mammarily epithelial cells which were primarily culturedin vitro.【Method】Bovine interleukin-17 gene(bIL-17)was amplified from the spleen tissue of cow by RT-PCR，which was inserted into pMD19-T vector and then sequenced.ThebIL-17 was inserted into an expression vector pEGFP-N3 carrying the enhanced green fluorescent protein to generate a new plasmid pEGFP-N3-bIL-17.The pEGFP-N3-bIL-17 eukaryotic expression vector was transfected into bovine primary mammary epithelial cells with LipofectamineTM2000 liposome.After the transfection，the green fluorescent protein was observed under fluorescence microscopy，andbIL-17 transcription was examined by RT-PCR and bIL-17 protein expression in cells detected by ELISA methods.【Result and conclusion】The recombinant vector pEGFP-N3-bIL-17 with a green fluorescence and neomycin resistance was constructed and bIL-17 protein could be normally expressed in mammary epithelial cells.

bovine interleukin-17(bIL-17);vector construction;bovine primary mammary epithelial cell;transfection;expression

S852.42

A

1001-411X(2014)01-0079-07

王婷，崔新潔，劉秉春，等.牛白細(xì)胞介素-17真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(1)：79-85.

2013-02-04優(yōu)先出版時(shí)間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1459.002.html

王婷(1990—)，女，碩士研究生，E-mail:fenziwang90@gmail.com;通信作者:王瀟(1978—)，男，副教授，博士，E-mail:wxiao1978@yahoo.com.cn

國家自然科學(xué)基金(30901066);內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2010MS0514)