不同表型表皮葡萄球菌之間的相互作用及LuxS基因?qū)ι锬ば纬傻挠绊?/h1>
2014-09-08 09:53:30王賢聰周樹生曹曉光戴媛媛
安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2014年5期
王賢聰，劉 寶，周樹生，曹曉光，戴媛媛
不同表型表皮葡萄球菌之間的相互作用及LuxS基因?qū)ι锬ば纬傻挠绊?/p>
王賢聰1，劉 寶1，周樹生1，曹曉光1，戴媛媛2
目的 探討不同表型的表皮葡萄球菌（SE）之間的相互作用機(jī)制以及l(fā)uxS基因在SE形成生物膜過程中所起的作用。方法 分別應(yīng)用TSB培養(yǎng)液、ATCC12228上清液以及ATCC35984上清液培養(yǎng)產(chǎn)生生物膜的SE標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984和不產(chǎn)生生物膜的ATCC12228菌株，并采用半定量法檢測細(xì)菌間多糖黏附素（PIA）以及半定量PCR法檢測LuxS基因在該菌株中的表達(dá)。結(jié)果 在TSB培養(yǎng)液中，ATCC35984菌株能形成致密完整的生物膜，而ATCC12228菌株不能產(chǎn)生生物膜。在ATCC35984上清液中，ATCC12228菌株形成生物膜的能力增強(qiáng)，LuxS基因表達(dá)降低。在ATCC12228菌株上清液中，ATCC35984產(chǎn)生生物膜能力下降，LuxS基因表達(dá)增強(qiáng)，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 LuxS基因在SE形成生物膜的過程中起一定作用，并且不同表型的SE之間存在相互影響的現(xiàn)象。
QS系統(tǒng);LuxS基因;半定量PCR;表皮葡萄球菌
群體感應(yīng)信號(hào)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)是細(xì)菌間通過分泌和探測化學(xué)信號(hào)分子－自體誘導(dǎo)分子（auto inducers，AIs）來監(jiān)測群體密度，協(xié)調(diào)細(xì)菌生物功能的信息交流機(jī)制［1］。QS系統(tǒng)由AIs、感應(yīng)分子及下游調(diào)控蛋白構(gòu)成，根據(jù)細(xì)菌合成的信號(hào)分子和感應(yīng)機(jī)制不同，QS系統(tǒng)分為革蘭陰性菌的酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acylated homoserine lactones，AHL）系統(tǒng)、革蘭陽性菌中寡肽介導(dǎo)的雙組分感應(yīng)系統(tǒng)以及種內(nèi)及種間依賴LuxS/AI-2的QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)。當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到一定閾值濃度時(shí)，該信號(hào)分子與細(xì)菌表面的相關(guān)受體結(jié)合，激活下游相關(guān)靶基因調(diào)節(jié)細(xì)菌生物學(xué)性狀，如生物膜形成、毒力的產(chǎn)生及生物發(fā)光等［2］。研究［3］顯示，在同一菌種內(nèi)及不同菌種間存在共同的信號(hào)分子－AI-2來介導(dǎo)細(xì)菌之間的信息交流，該信號(hào)是由LuxS基因編碼的LuxS蛋白酶催化產(chǎn)生，并通過下調(diào)生物膜胞外多糖來降低細(xì)菌之間的黏附?，F(xiàn)對(duì)不同表型表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）中LuxS/AI-2群體感應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行研究，探討LuxS基因在SE形成生物膜過程中的作用，以及不同SE菌種之間的相互作用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來源 SE標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984［多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）表型陽性，生物膜表型陽性］和 SE標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12228（PIA表型陰性，生物膜表型陰性）均購于美國ATCC公司。
1.1.2 試劑與儀器 TSB培養(yǎng)液購于英國 Oxiod公司;PCR引物購于上海捷瑞生物工程有限公司;RNA提取試劑盒購于美國Promega公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司;溶菌酶、葡萄球菌溶素購于美國Sigma公司;PCR儀購于德國Tgradient Biometra公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)菌上清液提取及分組 將血平板上SE單個(gè)菌落接種到5 ml TSB培養(yǎng)液中，搖菌培養(yǎng)（37℃，100 r/min）8 h，4 000 r/min 離心 30 min，取上清液，并將上清液進(jìn)行涂片，革蘭染色后鏡檢，無細(xì)菌為合格上清液，－80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。該研究分別命名 SE ATCC35984上清液為上清液 1，SE ATCC12228上清液為上清液2。將提取的上清液相互交叉加樣，共分為 3組，分別為:A組 SE ATCC35984菌株組（對(duì)照組A1:用TSB培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)組A2:用上清液2培養(yǎng)）、B組SE ATCC12228菌株組（對(duì)照組B1:用TSB培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)組B2:用上清液1培養(yǎng)）及C組空白對(duì)照組（對(duì)照組C1:TSB液;對(duì)照組C2:上清液1;對(duì)照組C3:上清液2）。
1.2.2 剛果紅瓊脂法PIA定性檢測 將心腦浸液肉湯18.5 g、蔗糖25 g、瓊脂5 g及剛果紅0.4 g溶于蒸餾水500 ml，121℃，高壓滅菌20 min制備剛果紅平板。分別將對(duì)照菌株及實(shí)驗(yàn)菌株搖菌培養(yǎng)（37℃，100 r/min）過夜，轉(zhuǎn)種至剛果紅平板中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。
1.2.3 半定量法檢測細(xì)菌生物膜 參照文獻(xiàn)［4］方法，將血平板中單個(gè)菌落接種于5 ml TSB培養(yǎng)液中，調(diào)成0.5麥?zhǔn)隙?，搖菌培養(yǎng)（37℃，100 r/min）過夜。分別將 A1和 A2組菌液用 TSB培養(yǎng)液作1∶100稀釋，實(shí)驗(yàn)組A2使用上清液2液按1∶100稀釋，實(shí)驗(yàn)組B2菌液使用上清液1作1∶100稀釋后，加入96孔培養(yǎng)板中，每株細(xì)菌接種6個(gè)平行孔，每孔200 μl。在該培養(yǎng)板中分別接種TSB培養(yǎng)液、上清液1、上清液2各200 μl作為對(duì)照。將96孔培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)24 h后，蒸餾水洗板3次，晾干，每孔0.1%結(jié)晶紫200 μl染色5 min，蒸餾水洗板3次，晾干，用酶標(biāo)儀在570 nm波長比色，計(jì)算每株細(xì)菌的平均吸光度（optical density，OD）值。
1.2.4 RT-PCR法檢測LuxS基因表達(dá) 分別將對(duì)照菌株及實(shí)驗(yàn)菌株振搖培養(yǎng)（37℃，100 r/min）12 h，加入5 μl溶葡萄球菌酶，繼續(xù)振搖培養(yǎng)6 h，離心收集細(xì)菌，按RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總RNA。取5 μl總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，－20℃凍存?zhèn)溆?。? μl cDNA作為模板用于PCR擴(kuò)增（總反應(yīng)體系50 μl）。引物序列及長度:LuxS上游引物:5'-CAATAAGGAGGATGTCGACATGACATGACTAAAATGAATG-3'，下游引物:5'-TTAGTTGTATTGTCTGCAGTTTACCTTCTCCGTAG-3'，582 bp;內(nèi)參基因 β-actin 上游引物:5'-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3'，下游引物:5'-ATCTACGATTACTAGCGATTCCA-3'，185 bp。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃ 4 min、94 ℃ 30 s、57.2 ℃ 30 s、72℃ 1 min循環(huán)33次，72℃ 5 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，拍照記錄結(jié)果。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
2 結(jié)果
2.1 不同表型的SE菌落在剛果紅平板上的生長情況 在對(duì)照組A1中，SE ATCC35984菌株菌落在剛果紅平板上呈黑色、光亮、干燥菌落，提示為高產(chǎn)PIA菌株，而在實(shí)驗(yàn)組A2中，該菌株菌落為底黑酒紅色，說明該菌株產(chǎn)生生物膜能力下降。在對(duì)照組B1中，菌株菌落在剛果紅平板上呈紅色光滑菌落，而實(shí)驗(yàn)組B2菌株在剛果紅平板上呈底黑酒紅色，見圖1。
圖1 不同表型SE菌株在剛果紅培養(yǎng)基上生長情況
2.2 不同表型的SE經(jīng)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后在96孔板中產(chǎn)生生物膜情況 對(duì)照組A1中菌株形成較厚且致密的生物膜，而實(shí)驗(yàn)組A2中菌株形成的生物膜較薄，比較稀疏。兩組菌株OD值之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組B1中菌株不能形成生物膜，而經(jīng)上清液1培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組B2菌株能形成明顯的生物膜，兩組菌株OD值之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另其他C組空白對(duì)照組中 TSB培養(yǎng)液、SE ATCC35984上清液、SE ATCC12228上清液均不能形成生物膜，見圖2、表1。
圖2 不同表型SE菌株在96孔板中形成生物膜情況
表1 不同表型SE在96孔板中形成生物膜的OD值（±s）
表1 不同表型SE在96孔板中形成生物膜的OD值（±s）
菌株（SE） 組別 OD值 t值 P值A(chǔ)TCC35984 對(duì)照組 A11.578 ±0.12914.066 0.00實(shí)驗(yàn)組 A2 2.652 ±0.136 ATCC12228 對(duì)照組 B1 0.106 ±0.007 10.929 0.00實(shí)驗(yàn)組B2 0.977 ±0.195
2.3 RT-PCR法檢測目的基因 在4組菌株中LuxS均有表達(dá)，在582 bp處可見一組亮色條帶。但在對(duì)照組（A1和B1）中，SE ATCC12228菌株條帶比SE ATCC35984菌株條帶亮度明顯增加，其吸光度比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組A2 SE ATCC35984菌株條帶亮度較對(duì)照組A1有所增加，其吸光度比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組B2 SE ATCC12228菌株條帶亮度較對(duì)照組B1減弱，其吸光度比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。
圖3 RT-PCR法檢測LuxS基因在不同表型SE中表達(dá)水平
3 討論
LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)是在研究一種海洋微生物哈氏弧菌首次被發(fā)現(xiàn)的，哈氏弧菌不僅能感應(yīng)AI-1類信號(hào)分子，還能通過感應(yīng)AI-2類信號(hào)分子來調(diào)節(jié)生物發(fā)光。McNab et al［5］發(fā)現(xiàn)在兩種口腔微生物聯(lián)合起來形成混種生物膜入侵牙周組織的過程中，LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)種間調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。在實(shí)驗(yàn)組A2中，經(jīng)SE ATCC12228上清液培養(yǎng)的SE ATCC35984菌株形成生物膜的能力大大下降，反之，在實(shí)驗(yàn)組 B2中不能形成生物膜的 SE ATCC12228菌株通過高產(chǎn)生物膜SE ATCC35984上清液培養(yǎng)后，具有了形成生物膜的能力。由此推測，該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是由于加入的上清液中存在AI-2信號(hào)系統(tǒng)，從而使原菌株的生物學(xué)行為發(fā)生趨向性的轉(zhuǎn)變。Karim et al［6］發(fā)現(xiàn)，通過加入純化的外源性AI-2信號(hào)，一種致牙周病的細(xì)菌同源菌株的突變株能夠形成致密的生物膜。
Xu et al［7］構(gòu)建了 SE LuxS 基因同源突變株，與野生株相比，LuxS突變株更容易形成更厚更致密的生物膜，并且容易導(dǎo)致動(dòng)物模型中導(dǎo)管相關(guān)性感染。LuxS基因可能通過調(diào)控ica基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄影響PIA產(chǎn)生，從而影響生物膜的產(chǎn)生。本研究表明在高產(chǎn)PIA的SE菌株其LuxS基因表達(dá)降低，反之在低PIA菌株其LuxS基因表達(dá)增高。在實(shí)驗(yàn)組A2中的SE ATCC35984菌株形成生物膜的能力有所下降，但是沒有完全失去形成生物膜的能力，而實(shí)驗(yàn)組B2中SE ATCC1222菌株形成的生物膜的厚度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組A1。由此推測，在培養(yǎng)的早期，由于培養(yǎng)液中存在AI-2信號(hào)，菌株上相應(yīng)的受體與AI-2信號(hào)分子結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列的生物學(xué)效應(yīng)，但隨著細(xì)菌不斷繁殖，原有的AI-2信號(hào)不斷消耗，無法達(dá)到一定的閾值，而不能進(jìn)一步調(diào)控細(xì)菌生物膜的產(chǎn)生。但LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)是如何調(diào)控細(xì)菌生物膜的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。
綜上所述，LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)在表皮葡萄球菌形成生物膜過程中起重要調(diào)節(jié)作用。目前由于多重耐藥菌的產(chǎn)生，迫切需要一種新的替代方法來控制致病菌。大多數(shù)細(xì)菌均通過QS系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細(xì)菌生物學(xué)行為，因此通過干擾細(xì)菌的該系統(tǒng)有望成為一種新型有效的抗菌手段。
［1］Reading N C，Sperandio V.Quorum sensing:the many languages of bacteria［J］.FEMS Microbiol Lett，2009，254（1）:1－11.
［2］Novick R P.Autoinduction and signal transduction in the regulation ofstaphylococcalvirulence［J］.Mol Microbiol，2010，48（6）:1429－49.
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［4］Bemado D H，F(xiàn)ortino S S，Blanca L M，et al.Production oficaADBC-encoded polysaccharide intercellular adhesion and therapeutic failure in pediatric patients withstaphulococcaldevice-related infections［J］.BMC Infect Dis，2010，10（68）:1－ 6.
［5］McNab R，F(xiàn)ord S K，El-Sabaeny A，et al.LuxS-based signaling inStreptococcusgordonii:autoinducer 2 controls carbohydrate metabolism and biofilm formation with Porphyromonas ［J］.Bacteriol，2003，18（5）:274－84.
［6］Karim M M，Hisamoto T，Matsunaga T，et al.LuxS affects biofilm maturation and detachment of the periodontopathogenic bacteriumEikenella corrodens［J］.J Biosci Bioeng，2013，116（3）:313－8.
［7］Xu L，Li H，Vuong C，et al.Role of the luxS quorum-sensing system in biofilm formation and virulence ofStaphylococcus epidermidis［J］.Infect Immun，2006，74（6）:488－96.
The interaction of different phenotypeStaphylococcus epidermidisand the influence of Luxs gene on biofilm formation
Wang Xiancong，Liu Bao，Zhou Shusheng，et al
（Dept of ICU，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）
ObjectiveTo investigate the interaction mechanisms between the different phenotype ofStaphylococcus epidermidisand the role of LuxS in the process of biofilm formation.MethodsSE ATCC35984 with the ability of biofilm formation and SE ATCC12228 without this ability was cultured respectively with TSB medium，SE ATCC12228 supernatant and SE ATCC35984 supematant.After 18h，polysaccharide intercellular adhesion and the expression of LuxS in the strain were detected by semi-quantitative method and semi-quantitative PCR method.ResultsThe strain of SE ATCC35984 cultured by TSB formed dense and compact biofilm，while the strain of SE ATCC12228 was unable to produce biological membrance.Cultured by SE ATCC35984 supematant，the ability of SE ATCC12228 biofilm formation was increased，and the expression of LuxS in the strain was reduced.Similarly，the biofilm formation ability was reduced and the expression of LuxS was increased in the strain of SE ATCC35984 cultured by ATCC12228 supernatant.The differences among these groups were significant（P＜0.05）.ConclusionLuxS plays a key role in the process of biofilm formation ofStaphylococcus epidermidis，and the different phenotype ofStaphylococcus epidermidisinteract with each other.
QS system;LuxS;semi-quantitative PCR;Staphylococcus epidermidis
R 378.11
A
1000－1492（2014）05－0610－04
2013－11－25接收
安徽省教育廳課題基金資助項(xiàng)目（編號(hào):KJ2009B001Z）
安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1ICU、2細(xì)菌室，合肥230001
王賢聰，男，碩士研究生;
劉 寶，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:linux306@126.com
王賢聰，劉 寶，周樹生，曹曉光，戴媛媛
不同表型表皮葡萄球菌之間的相互作用及LuxS基因?qū)ι锬ば纬傻挠绊?/p>
王賢聰1，劉 寶1，周樹生1，曹曉光1，戴媛媛2
目的 探討不同表型的表皮葡萄球菌（SE）之間的相互作用機(jī)制以及l(fā)uxS基因在SE形成生物膜過程中所起的作用。方法 分別應(yīng)用TSB培養(yǎng)液、ATCC12228上清液以及ATCC35984上清液培養(yǎng)產(chǎn)生生物膜的SE標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984和不產(chǎn)生生物膜的ATCC12228菌株，并采用半定量法檢測細(xì)菌間多糖黏附素（PIA）以及半定量PCR法檢測LuxS基因在該菌株中的表達(dá)。結(jié)果 在TSB培養(yǎng)液中，ATCC35984菌株能形成致密完整的生物膜，而ATCC12228菌株不能產(chǎn)生生物膜。在ATCC35984上清液中，ATCC12228菌株形成生物膜的能力增強(qiáng)，LuxS基因表達(dá)降低。在ATCC12228菌株上清液中，ATCC35984產(chǎn)生生物膜能力下降，LuxS基因表達(dá)增強(qiáng)，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 LuxS基因在SE形成生物膜的過程中起一定作用，并且不同表型的SE之間存在相互影響的現(xiàn)象。
QS系統(tǒng);LuxS基因;半定量PCR;表皮葡萄球菌
群體感應(yīng)信號(hào)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)是細(xì)菌間通過分泌和探測化學(xué)信號(hào)分子－自體誘導(dǎo)分子（auto inducers，AIs）來監(jiān)測群體密度，協(xié)調(diào)細(xì)菌生物功能的信息交流機(jī)制［1］。QS系統(tǒng)由AIs、感應(yīng)分子及下游調(diào)控蛋白構(gòu)成，根據(jù)細(xì)菌合成的信號(hào)分子和感應(yīng)機(jī)制不同，QS系統(tǒng)分為革蘭陰性菌的酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acylated homoserine lactones，AHL）系統(tǒng)、革蘭陽性菌中寡肽介導(dǎo)的雙組分感應(yīng)系統(tǒng)以及種內(nèi)及種間依賴LuxS/AI-2的QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)。當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到一定閾值濃度時(shí)，該信號(hào)分子與細(xì)菌表面的相關(guān)受體結(jié)合，激活下游相關(guān)靶基因調(diào)節(jié)細(xì)菌生物學(xué)性狀，如生物膜形成、毒力的產(chǎn)生及生物發(fā)光等［2］。研究［3］顯示，在同一菌種內(nèi)及不同菌種間存在共同的信號(hào)分子－AI-2來介導(dǎo)細(xì)菌之間的信息交流，該信號(hào)是由LuxS基因編碼的LuxS蛋白酶催化產(chǎn)生，并通過下調(diào)生物膜胞外多糖來降低細(xì)菌之間的黏附?，F(xiàn)對(duì)不同表型表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）中LuxS/AI-2群體感應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行研究，探討LuxS基因在SE形成生物膜過程中的作用，以及不同SE菌種之間的相互作用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來源 SE標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984［多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）表型陽性，生物膜表型陽性］和 SE標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12228（PIA表型陰性，生物膜表型陰性）均購于美國ATCC公司。
1.1.2 試劑與儀器 TSB培養(yǎng)液購于英國 Oxiod公司;PCR引物購于上海捷瑞生物工程有限公司;RNA提取試劑盒購于美國Promega公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司;溶菌酶、葡萄球菌溶素購于美國Sigma公司;PCR儀購于德國Tgradient Biometra公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)菌上清液提取及分組 將血平板上SE單個(gè)菌落接種到5 ml TSB培養(yǎng)液中，搖菌培養(yǎng)（37℃，100 r/min）8 h，4 000 r/min 離心 30 min，取上清液，并將上清液進(jìn)行涂片，革蘭染色后鏡檢，無細(xì)菌為合格上清液，－80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。該研究分別命名 SE ATCC35984上清液為上清液 1，SE ATCC12228上清液為上清液2。將提取的上清液相互交叉加樣，共分為 3組，分別為:A組 SE ATCC35984菌株組（對(duì)照組A1:用TSB培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)組A2:用上清液2培養(yǎng)）、B組SE ATCC12228菌株組（對(duì)照組B1:用TSB培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)組B2:用上清液1培養(yǎng)）及C組空白對(duì)照組（對(duì)照組C1:TSB液;對(duì)照組C2:上清液1;對(duì)照組C3:上清液2）。
1.2.2 剛果紅瓊脂法PIA定性檢測 將心腦浸液肉湯18.5 g、蔗糖25 g、瓊脂5 g及剛果紅0.4 g溶于蒸餾水500 ml，121℃，高壓滅菌20 min制備剛果紅平板。分別將對(duì)照菌株及實(shí)驗(yàn)菌株搖菌培養(yǎng)（37℃，100 r/min）過夜，轉(zhuǎn)種至剛果紅平板中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。
1.2.3 半定量法檢測細(xì)菌生物膜 參照文獻(xiàn)［4］方法，將血平板中單個(gè)菌落接種于5 ml TSB培養(yǎng)液中，調(diào)成0.5麥?zhǔn)隙?，搖菌培養(yǎng)（37℃，100 r/min）過夜。分別將 A1和 A2組菌液用 TSB培養(yǎng)液作1∶100稀釋，實(shí)驗(yàn)組A2使用上清液2液按1∶100稀釋，實(shí)驗(yàn)組B2菌液使用上清液1作1∶100稀釋后，加入96孔培養(yǎng)板中，每株細(xì)菌接種6個(gè)平行孔，每孔200 μl。在該培養(yǎng)板中分別接種TSB培養(yǎng)液、上清液1、上清液2各200 μl作為對(duì)照。將96孔培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)24 h后，蒸餾水洗板3次，晾干，每孔0.1%結(jié)晶紫200 μl染色5 min，蒸餾水洗板3次，晾干，用酶標(biāo)儀在570 nm波長比色，計(jì)算每株細(xì)菌的平均吸光度（optical density，OD）值。
1.2.4 RT-PCR法檢測LuxS基因表達(dá) 分別將對(duì)照菌株及實(shí)驗(yàn)菌株振搖培養(yǎng)（37℃，100 r/min）12 h，加入5 μl溶葡萄球菌酶，繼續(xù)振搖培養(yǎng)6 h，離心收集細(xì)菌，按RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總RNA。取5 μl總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，－20℃凍存?zhèn)溆?。? μl cDNA作為模板用于PCR擴(kuò)增（總反應(yīng)體系50 μl）。引物序列及長度:LuxS上游引物:5'-CAATAAGGAGGATGTCGACATGACATGACTAAAATGAATG-3'，下游引物:5'-TTAGTTGTATTGTCTGCAGTTTACCTTCTCCGTAG-3'，582 bp;內(nèi)參基因 β-actin 上游引物:5'-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3'，下游引物:5'-ATCTACGATTACTAGCGATTCCA-3'，185 bp。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃ 4 min、94 ℃ 30 s、57.2 ℃ 30 s、72℃ 1 min循環(huán)33次，72℃ 5 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，拍照記錄結(jié)果。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
2 結(jié)果
2.1 不同表型的SE菌落在剛果紅平板上的生長情況 在對(duì)照組A1中，SE ATCC35984菌株菌落在剛果紅平板上呈黑色、光亮、干燥菌落，提示為高產(chǎn)PIA菌株，而在實(shí)驗(yàn)組A2中，該菌株菌落為底黑酒紅色，說明該菌株產(chǎn)生生物膜能力下降。在對(duì)照組B1中，菌株菌落在剛果紅平板上呈紅色光滑菌落，而實(shí)驗(yàn)組B2菌株在剛果紅平板上呈底黑酒紅色，見圖1。
圖1 不同表型SE菌株在剛果紅培養(yǎng)基上生長情況
2.2 不同表型的SE經(jīng)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后在96孔板中產(chǎn)生生物膜情況 對(duì)照組A1中菌株形成較厚且致密的生物膜，而實(shí)驗(yàn)組A2中菌株形成的生物膜較薄，比較稀疏。兩組菌株OD值之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組B1中菌株不能形成生物膜，而經(jīng)上清液1培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組B2菌株能形成明顯的生物膜，兩組菌株OD值之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另其他C組空白對(duì)照組中 TSB培養(yǎng)液、SE ATCC35984上清液、SE ATCC12228上清液均不能形成生物膜，見圖2、表1。
圖2 不同表型SE菌株在96孔板中形成生物膜情況
表1 不同表型SE在96孔板中形成生物膜的OD值（±s）
表1 不同表型SE在96孔板中形成生物膜的OD值（±s）
菌株（SE） 組別 OD值 t值 P值A(chǔ)TCC35984 對(duì)照組 A11.578 ±0.12914.066 0.00實(shí)驗(yàn)組 A2 2.652 ±0.136 ATCC12228 對(duì)照組 B1 0.106 ±0.007 10.929 0.00實(shí)驗(yàn)組B2 0.977 ±0.195
2.3 RT-PCR法檢測目的基因 在4組菌株中LuxS均有表達(dá)，在582 bp處可見一組亮色條帶。但在對(duì)照組（A1和B1）中，SE ATCC12228菌株條帶比SE ATCC35984菌株條帶亮度明顯增加，其吸光度比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組A2 SE ATCC35984菌株條帶亮度較對(duì)照組A1有所增加，其吸光度比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組B2 SE ATCC12228菌株條帶亮度較對(duì)照組B1減弱，其吸光度比值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。
圖3 RT-PCR法檢測LuxS基因在不同表型SE中表達(dá)水平
3 討論
LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)是在研究一種海洋微生物哈氏弧菌首次被發(fā)現(xiàn)的，哈氏弧菌不僅能感應(yīng)AI-1類信號(hào)分子，還能通過感應(yīng)AI-2類信號(hào)分子來調(diào)節(jié)生物發(fā)光。McNab et al［5］發(fā)現(xiàn)在兩種口腔微生物聯(lián)合起來形成混種生物膜入侵牙周組織的過程中，LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)種間調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。在實(shí)驗(yàn)組A2中，經(jīng)SE ATCC12228上清液培養(yǎng)的SE ATCC35984菌株形成生物膜的能力大大下降，反之，在實(shí)驗(yàn)組 B2中不能形成生物膜的 SE ATCC12228菌株通過高產(chǎn)生物膜SE ATCC35984上清液培養(yǎng)后，具有了形成生物膜的能力。由此推測，該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是由于加入的上清液中存在AI-2信號(hào)系統(tǒng)，從而使原菌株的生物學(xué)行為發(fā)生趨向性的轉(zhuǎn)變。Karim et al［6］發(fā)現(xiàn)，通過加入純化的外源性AI-2信號(hào)，一種致牙周病的細(xì)菌同源菌株的突變株能夠形成致密的生物膜。
Xu et al［7］構(gòu)建了 SE LuxS 基因同源突變株，與野生株相比，LuxS突變株更容易形成更厚更致密的生物膜，并且容易導(dǎo)致動(dòng)物模型中導(dǎo)管相關(guān)性感染。LuxS基因可能通過調(diào)控ica基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄影響PIA產(chǎn)生，從而影響生物膜的產(chǎn)生。本研究表明在高產(chǎn)PIA的SE菌株其LuxS基因表達(dá)降低，反之在低PIA菌株其LuxS基因表達(dá)增高。在實(shí)驗(yàn)組A2中的SE ATCC35984菌株形成生物膜的能力有所下降，但是沒有完全失去形成生物膜的能力，而實(shí)驗(yàn)組B2中SE ATCC1222菌株形成的生物膜的厚度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組A1。由此推測，在培養(yǎng)的早期，由于培養(yǎng)液中存在AI-2信號(hào)，菌株上相應(yīng)的受體與AI-2信號(hào)分子結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列的生物學(xué)效應(yīng)，但隨著細(xì)菌不斷繁殖，原有的AI-2信號(hào)不斷消耗，無法達(dá)到一定的閾值，而不能進(jìn)一步調(diào)控細(xì)菌生物膜的產(chǎn)生。但LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)是如何調(diào)控細(xì)菌生物膜的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。
綜上所述，LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)在表皮葡萄球菌形成生物膜過程中起重要調(diào)節(jié)作用。目前由于多重耐藥菌的產(chǎn)生，迫切需要一種新的替代方法來控制致病菌。大多數(shù)細(xì)菌均通過QS系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細(xì)菌生物學(xué)行為，因此通過干擾細(xì)菌的該系統(tǒng)有望成為一種新型有效的抗菌手段。
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The interaction of different phenotypeStaphylococcus epidermidisand the influence of Luxs gene on biofilm formation
Wang Xiancong，Liu Bao，Zhou Shusheng，et al
（Dept of ICU，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）
ObjectiveTo investigate the interaction mechanisms between the different phenotype ofStaphylococcus epidermidisand the role of LuxS in the process of biofilm formation.MethodsSE ATCC35984 with the ability of biofilm formation and SE ATCC12228 without this ability was cultured respectively with TSB medium，SE ATCC12228 supernatant and SE ATCC35984 supematant.After 18h，polysaccharide intercellular adhesion and the expression of LuxS in the strain were detected by semi-quantitative method and semi-quantitative PCR method.ResultsThe strain of SE ATCC35984 cultured by TSB formed dense and compact biofilm，while the strain of SE ATCC12228 was unable to produce biological membrance.Cultured by SE ATCC35984 supematant，the ability of SE ATCC12228 biofilm formation was increased，and the expression of LuxS in the strain was reduced.Similarly，the biofilm formation ability was reduced and the expression of LuxS was increased in the strain of SE ATCC35984 cultured by ATCC12228 supernatant.The differences among these groups were significant（P＜0.05）.ConclusionLuxS plays a key role in the process of biofilm formation ofStaphylococcus epidermidis，and the different phenotype ofStaphylococcus epidermidisinteract with each other.
QS system;LuxS;semi-quantitative PCR;Staphylococcus epidermidis
R 378.11
A
1000－1492（2014）05－0610－04
2013－11－25接收
安徽省教育廳課題基金資助項(xiàng)目（編號(hào):KJ2009B001Z）
安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1ICU、2細(xì)菌室，合肥230001
王賢聰，男，碩士研究生;
劉 寶，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:linux306@126.com
