袁 偉 劉 輝 陳美雪 潘莉萍#

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(443003) 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院消化科2

腸缺血再灌注(I/R)損傷是腸器官缺血后恢復(fù)血液循環(huán)過程中難以避免的一種嚴重損傷，常見于失血性休克、感染、創(chuàng)傷、燒傷等[1]。腸I/R損傷容易導(dǎo)致腸道屏障功能降低，腸道內(nèi)毒素和細菌等有害物質(zhì)易通過受損的腸黏膜進入體循環(huán)，引發(fā)大量細胞因子和炎癥介質(zhì)釋放，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，甚至多器官功能衰竭(MOF)[1-3]。近年研究顯示過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)在腸I/R損傷中起重要作用[4]。本實驗利用血管夾夾閉小鼠腸系膜上動脈(SMA)構(gòu)建腸I/R損傷模型，旨在研究PPARγ激動劑羅格列酮預(yù)處理對腸I/R損傷的作用，并探討其可能的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑和儀器

18只健康雄性C57BL/6小鼠購自武漢大學(xué)實驗動物中心，SPF級，2月齡，平均體質(zhì)量20～25 g，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)院動物實驗中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

羅格列酮(美國Sigma-Aldrich)，DMSO、水合氯醛(武漢谷歌生物科技有限公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國GeneCopoeia)，SYBR Green PCR Master Mix(Takara)，PCR引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、Smad3單克隆抗體(Cell Signaling Technology, Inc)，β-actin單克隆抗體(美國Abgent)，腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ和白細胞介素(IL)-1β ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)。紫外分光光度計、逆轉(zhuǎn)錄儀、PCR儀、顯微鏡和成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均由同濟醫(yī)院肝病研究所提供。

二、研究方法

1. 動物模型的建立與分組：18只小鼠按體質(zhì)量隨機分為假手術(shù)組、腸I/R損傷組和羅格列酮預(yù)處理組，每組各6只。羅格列酮預(yù)處理組小鼠造模前30 min靜脈注射羅格列酮0.3 mg/kg，假手術(shù)組和I/R損傷組靜脈注射等體積0.9% NaCl溶液。I/R損傷組和羅格列酮預(yù)處理組小鼠麻醉后行腹部正中切口，鈍性分離SMA根部，用微血管夾夾閉SMA根部，完全阻斷血流30 min后松開血管夾，恢復(fù)腸道血流形成再灌注，誘導(dǎo)I/R損傷模型[5]。假手術(shù)組小鼠開腹后不夾閉SMA?？p合腹部，術(shù)畢放回動物房。實驗中，動物狀態(tài)較好，蘇醒較快，無死亡動物。術(shù)后給予正常飲食飲水。松開血管夾腸道再灌注4 h后處死所有小鼠，收集小腸標本。

2. 小腸組織學(xué)檢查：小腸組織切片經(jīng)4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織病理學(xué)變化。小腸損傷程度采用Lenaerts等[2]的方法進行評估。0分：正常絨毛和腺體；1分：部分絨毛頂部上皮輕度受損；2分：上皮下腺體輕度受損；3分：上皮下間隙擴大，毛細血管充血；4分：上皮與固有層中度分離，腺體受損；5分：部分絨毛頂部脫落；6分：絨毛脫落明顯，毛細血管擴張；7分：固有層絨毛脫落，腺體受損明顯；8分：固有層開始消化分解；9分：出血、潰瘍。

3. 實時定量PCR(qPCR)法：稱取適量小腸組織，提取總RNA，紫外分光光度計測量濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TNF-α上游：5′-CTG AAC TTC GGG GTG ATC GG-3′，下游：5′-GGC TTG TCA CTC GAA TTT GAG A-3′；IFN-γ上游：5′-ATG AAC GCT ACA CAC TGC ATC-3′，下游：5′-CCA TCC TTT TGC CAG TTC CTC -3′；IL-1β上游：5′-CTG CAA GAG ACT TCC ATC CAG-3′，下游：5′-CCA TCC TTT TGC CAG TTC CTC-3′；TGF-β上游：5′-TTA CGT CAT GTG GGA ACC CG-3′，下游：5′-AAG CAG CCC ACT GGA CCT TTG A-3′；Smad3上游：5′-AAT CAT CGT GAC CCT TGG GC-3′，下游：5′-TTC TAG TGA TGA CCT GGC CCT CT-3′；以β-actin作為內(nèi)參照，上游：5′-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3′，下游：5′-CAA TAG TGA TGA CCT GGC CGT-3′。以2-ΔΔCT法計算各目的基因的相對表達量。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：取50 mg小腸組織，加入1 mL RIPA裂解液，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質(zhì)的上樣量，行SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠，10%分離膠，恒壓80～100 V)后轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，恒流300 mA)，洗膜，5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h，分別加入TGF-β(1∶1 000)、Smad3(1∶500)、β-actin(1∶3 000)單克隆抗體孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，曝光顯影并拍照。采用Quantity one軟件對條帶進行定量分析，以目的條帶與β-actin條帶的比值作為目的蛋白表達。

5. ELISA法：血液標本4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，分離血清。采用雙抗夾心ABC-ELISA法檢測血清TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平，具體步驟參照試劑盒說明書。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、小腸組織病理學(xué)變化

光學(xué)顯微鏡下顯示，腸I/R損傷組小腸黏膜上皮下間隙明顯增大，腺體受損明顯，毛細血管大量充血，腫脹，小腸絨毛壞死脫落，大量炎性細胞浸潤；假手術(shù)組小腸黏膜細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，無腸道組織壞死、缺失和水腫；羅格列酮預(yù)處理組小腸黏膜上皮下間隙輕微增大，少量腺體受損以及部分毛細血管輕微充血、水腫，腸道組織可見少量絨毛脫落、糜爛、炎性細胞浸潤(圖1)。腸I/R損傷組病理學(xué)評分顯著高于假手術(shù)組(14.5±3.7對3.2±1.4，P<0.01)；經(jīng)羅格列酮預(yù)處理后，病理學(xué)評分顯著降低(8.1±3.6對14.5±3.7，P<0.01)。

1:假手術(shù)組；2:I/R損傷組；3:羅格列酮預(yù)處理組

二、TNF-α、IFN-γ和IL-1β mRNA表達

qPCR法顯示，與假手術(shù)組相比，I/R損傷組炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β mRNA表達水平均明顯上調(diào)(P<0.01)；經(jīng)羅格列酮預(yù)處理后，TNF-α、IFN-γ和IL-1β mRNA 表達水平均明顯下調(diào)(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組小腸炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β mRNA表達(qPCR法)

三、TGF-β、Smad3 mRNA和蛋白表達水平

qPCR和蛋白質(zhì)印跡法顯示，與假手術(shù)組相比，I/R損傷組TGF-β、Smad3 mRNA和蛋白表達水平均明顯上調(diào)(P<0.01)；經(jīng)羅格列酮預(yù)處理后，TGF-β、Smad3 mRNA和蛋白表達水平均明顯下調(diào)(P<0.05)(圖3)。

A:qPCR法；B、C:蛋白質(zhì)印跡法

四、血清炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平

ELISA法顯示，與假手術(shù)組相比，I/R損傷組血清炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平明顯升高(P<0.001)；經(jīng)羅格列酮預(yù)處理后，TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平均明顯下調(diào)(P<0.01)(圖4)。

圖4 各組血清炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β水平(ELISA法)

討 論

I/R損傷是機體器官缺血后恢復(fù)血液供應(yīng)而導(dǎo)致?lián)p傷加重的一種常見臨床損傷，常繼發(fā)于機體遭受嚴重創(chuàng)傷和感染，或接受器官移植等情況，極易導(dǎo)致嚴重不良后果[1-2]。小腸是對I/R損傷最敏感的器官之一，小腸移植、腸絞窄、腸梗阻和腸系膜血管缺血性疾病易導(dǎo)致小腸缺血性損傷。當小腸恢復(fù)血供時，再灌注損傷會加重對小腸的損傷[2]。腸I/R損傷易破壞腸道屏障功能，導(dǎo)致腸內(nèi)細菌和毒素等有害物質(zhì)通過受損的腸道黏膜進入機體循環(huán)，激活內(nèi)皮系統(tǒng)，引起TNF-α、IFN-γ、IL-1β等炎癥因子大量釋放，繼發(fā)大量炎癥介質(zhì)釋放，造成SIRS，甚至引發(fā)MOF等災(zāi)難性后果[5]。因此，采取切實有效措施避免或減少腸I/R損傷具有重要作用。

PPAR包括3種亞型，分別PPARα、PPARβ和PPARγ。PPARγ廣泛分布于腸道組織。羅格列酮為PPARγ激動劑，在臨床上廣泛用于2型糖尿病的治療。目前研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮對I/R損傷具有保護作用[6]。PPARγ激動劑可調(diào)節(jié)TGF-β/Smad3信號通路[7]，后者可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善I/R損傷[8]。多項研究發(fā)現(xiàn)Smad3缺失或降低可明顯減輕炎癥[9-11]，激活TGF-β可明顯加重炎癥[10-11]，因此抑制TGF-β/Smad3信號通路的激活可明顯減輕炎癥反應(yīng)。

本實驗結(jié)果顯示羅格列酮預(yù)處理可明顯減輕腸I/R導(dǎo)致的腸道充血、水腫、出血、壞死，腸絨毛毛細血管擴張、淤血，腸腺上皮細胞水腫和壞死脫落；促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β在腸道組織和血清中的表達均明顯降低，TGF-β、Smad3 mRNA和蛋白水平亦明顯降低。提示羅格列酮預(yù)處理可通過抑制TGF-β/Smad3信號通路的激活而減輕促炎因子的釋放，進而減輕炎癥反應(yīng)，減輕腸I/R損傷。

綜上所述，羅格列酮預(yù)處理可抑制TGF-β/Smad3信號通路的激活，減少促炎因子的釋放，降低炎癥反應(yīng)從而減輕腸I/R損傷。然而羅格列酮保護腸I/R損傷是否僅通過影響TGF-β/Smad3信號通路，還是通過影響其他信號通路共同作用的結(jié)果，以及羅格列酮直接作用于TGF-β/Smad3信號分子還是通過調(diào)節(jié)其上游激酶和(或)信號分子而間接發(fā)揮作用，上述問題仍未完全明確，今后將通過干擾和高表達TGF-β/Smad3來研究其在羅格列酮對腸I/R損傷保護中的具體作用。

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