王英 羅浩虹 高洪泉 繆智輝 趙亞清

·論著·

體外培養(yǎng)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化及對糖尿病治療的實驗研究

王英 羅浩虹 高洪泉 繆智輝 趙亞清

目的 研究人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能及其移植后對糖尿病大鼠的治療效果。方法 體外分離培養(yǎng)HUCB-MSCs, 在胰島細(xì)胞培養(yǎng)條件下經(jīng)藥物定向誘導(dǎo)其分化；免疫組化對誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行胰島β細(xì)胞標(biāo)記鑒定；雙硫腙染色鑒定鋅離子表達(dá)及檢測胰島樣細(xì)胞的移植效果。結(jié)果 HUCB-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后, 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示表達(dá)人胰島素；雙硫腙染色呈棕紅色；移植后2周, 胰島樣細(xì)胞組血糖濃度明顯降低。結(jié)論 HUCB-MSCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下, 具有向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能, 這種細(xì)胞可能為Ⅰ型糖尿病提供一條新的治療途徑。

人臍帶血；間充質(zhì)干細(xì)胞；定向誘導(dǎo)；糖尿病

2000年, Erices等［1］報道人臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell/ mesenchymal progenitor cell, MSC/MPC)。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells, UCB-MSCs)為中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞, 具有多向分化的潛在能力, 其形態(tài)和生物學(xué)特點與骨髓來源 MSCs 相似［2］。UCB-MSCs具備自我更新和增殖的能力, 并具備多向分化潛能特性。在一定條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化后具有向神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞等方向分化功能, 可作為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞和基因治療的載體細(xì)胞［3-5］。臍血又具有淋巴細(xì)胞抗原性弱、功能相對不成熟、移植后發(fā)生移植物抗宿主病的風(fēng)險較低等特點, 與其他類型的干細(xì)胞比較, 取材方便, 擴(kuò)增數(shù)大, 來源廣泛, 不受倫理和道德的限制, 因此臍血干細(xì)胞將以其自身的特性和優(yōu)勢占據(jù)重要的位置, 具有重大的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值［6］。

1 試劑與方法

1.1 試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(杭州四季青公司)；重組堿性成纖維生長因子(basic fibroblastgrowth factors, bFGF)、重組表皮生長因子(epidermisgrowth factors, EGF)、β-細(xì)胞調(diào)節(jié)素(PeproTech公司)；β-巰基乙醇(上海試劑四廠)；尼克酰胺、ITS、雙硫腙、B27(GBICO公司)；熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體CD49d、CD34(Bioscience美國)；小鼠抗人胰島素單克隆抗體 (Neomarkers公司)。

1.2 HUCB-MSCs表面標(biāo)記檢測 取第4代的HUCB-MSCs,經(jīng)消化后離心, 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml, 接種有蓋玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng), 當(dāng)細(xì)胞生長到融合狀態(tài)時, 取出蓋玻片, 再按照試劑盒說明進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色, 實驗組分別滴加50 μl一抗小鼠抗人抗體CD49d、CD34于蓋玻片上, 然后按照常規(guī)細(xì)胞化學(xué)染色方法進(jìn)行操作。空白對照組用PBS代替一抗。倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3 體外誘導(dǎo)后胰島細(xì)胞檢測

1.3.1 雙硫腙的染色 誘導(dǎo)方法參考［7］。6孔培養(yǎng)板中將誘導(dǎo)約12 d及未誘導(dǎo)的細(xì)胞, PBS洗2遍, 然后每個孔分別加入1 ml PBS和10 μl雙硫腙儲存液, 充分混勻, 置37℃孵育20 min后, PBS洗3次, 倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將誘導(dǎo)12 d的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色, 用小鼠抗人胰島素單克隆抗體作為一抗,參照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作, DAB染色、脫水、透明、封片, 光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。對照組用PBS代替一抗。采用圖像分析儀進(jìn)行結(jié)果分析。選取10個高倍鏡的視野計數(shù)細(xì)胞總數(shù)以及陽性細(xì)胞數(shù), 計算誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率＝陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件處理數(shù)據(jù), 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)來表示, 進(jìn)行t檢驗, P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 胰島樣細(xì)胞移植造模糖尿病大鼠

1.4.1 大鼠糖尿病模型的制備［8］將12只SD大鼠隨機(jī)分為實驗組8只和對照組4只。實驗組大鼠空腹12 h后, 經(jīng)腹腔注射70 mg/kg鏈脲佐菌素(以0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解), 對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。兩組大鼠注射后2 d, 4 d, 6 d從尾靜脈采血檢測空腹血糖, 選連續(xù)3次血糖濃度高于16.7 mmol/L(正常值為2.80～7.56 mmol/L)的大鼠作為糖尿病模型。

1.4.2 胰島樣細(xì)胞團(tuán)的移植 8只實驗組分為4只胰島樣細(xì)胞組, 4只模型對照組。取2×106個的第4～8代HUCBMSCs用900 μl PBS重懸細(xì)胞, 吸入1 ml注射器內(nèi)經(jīng)尾靜脈注入糖尿病鼠體內(nèi)。模型對照組注入等體積的生理鹽水。各組大鼠均于移植前及移植后2 d檢測空腹血糖濃度, 以后每周定點檢測空腹血糖1次。

2 結(jié)果

2.1 貼壁細(xì)胞鑒定 對第4代貼壁細(xì)胞通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色, 結(jié)果顯示貼壁的細(xì)胞CD49d表達(dá)陽性, 細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色(見圖1)；而CD34表達(dá)陰性, 大部分細(xì)胞質(zhì)未著色, 細(xì)胞核為藍(lán)色(見圖2)。說明貼壁細(xì)胞為HUCB-MSCs。

圖1 CD49d陽性染色 (×200)

圖2 CD34陰性染色(×200)

2.2 誘導(dǎo)胰島細(xì)胞的檢測

2.2.1 胰島細(xì)胞雙硫腙(DTZ)染色結(jié)果 實驗組細(xì)胞在DTZ染色的過程中, 多數(shù)細(xì)胞由貼壁狀態(tài)變成懸浮細(xì)胞, 只有少數(shù)細(xì)胞保持貼壁狀態(tài)。DTZ是鉛試劑, 與胰島β細(xì)胞內(nèi)豐富的鋅離子結(jié)合染成了棕紅色。在倒置顯微鏡下觀察, 經(jīng)DTZ染色顯示多數(shù)細(xì)胞為棕紅色(見圖3)。對照組的細(xì)胞DTZ染色不著色。

圖3 雙硫腙顯色(棕紅色)×400

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)胰島素顯色(棕褐色)×200

2.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 在高糖等誘導(dǎo)環(huán)境下, UCB-MSCs聚集成為細(xì)胞團(tuán), 實驗組細(xì)胞可觀察到特異性的胰島素表達(dá),陽性細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)為棕褐色(見圖4)。說明細(xì)胞質(zhì)中有胰島素分泌, 細(xì)胞核淡黃色。對照組細(xì)胞質(zhì)染色呈陰性, 不含胰島素。實驗組以及對照組的誘導(dǎo)分化陽性率及灰度值見表1, 表2, 圖5, 圖6。

表1 12 d兔抗人胰島素抗體檢測結(jié)果( x-±s, %)

圖5 12 d誘導(dǎo)細(xì)胞兔抗人胰島素抗體表達(dá)柱形圖

表2 12 d圖像分析系統(tǒng)灰度值測定結(jié)果( x-±s) (背景染色：183.3674±3.2865)

圖6 12 d兔抗人胰島素抗體免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果灰度值比較

2.3 胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植效果檢測 血糖濃度正常的大鼠經(jīng)腹腔注射鏈脲菌素2 d后, 大鼠血糖的濃度迅速升高；4 d、6 d后大鼠血糖濃度均高于16.7 mmol/L。胰島樣細(xì)胞移植后2周, 胰島樣細(xì)胞組大鼠血糖濃度明顯降低, 模型對照組血糖濃度一直處于糖尿病血糖濃度范圍內(nèi)(見表3)。

表3 胰島樣細(xì)胞移植后不同時間點大鼠空腹血糖濃度的變化( x-±s, n=3, mmol/L)

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞來源于胚胎發(fā)育期的中胚層, 是間充質(zhì)細(xì)胞起源于微環(huán)境中的一類多能性前體細(xì)胞。近年來UCBMSCs作為一種同質(zhì)細(xì)胞群, 已經(jīng)被眾多實驗室成功分離。UCB-MSCs不僅在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可向外胚層、中胚層、內(nèi)胚層分化, 而且還有向傷處遷移的能力, 是基礎(chǔ)研究實驗材料的理想細(xì)胞和基因治療的載體。本實驗通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測分離培養(yǎng)的細(xì)胞表面標(biāo)記CD49d陽性表達(dá), CD34陰性表達(dá), 由此證明培養(yǎng)的細(xì)胞為HUCB-MSCs。

間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化胰島β細(xì)胞的誘導(dǎo)因素包括兩類：一類為啟動胰島β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的生物因子, 如bFGF、肝細(xì)胞生長因子、尼克酰胺等；另一類為誘導(dǎo) nestin蛋白的表達(dá), 如β-巰基乙醇、DMSO 等［9］。本實驗誘導(dǎo)方案分為三個階段, 第一、二階段HUCB-MSCs形態(tài)未見明顯變化, 細(xì)胞數(shù)量增長速度有所減慢;第三階段相鄰細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)變化, 開始逐漸變圓并聚集成胰島樣細(xì)胞團(tuán), 這些細(xì)胞團(tuán)呈類圓形, 大小不等。誘導(dǎo)后的細(xì)胞, 經(jīng)DTZ染色胰島細(xì)胞染成棕紅色, 經(jīng)胰島素免疫熒光染色檢測, 呈陽性反應(yīng), 而對照組則沒有著色。說明HUCB-MSCs 經(jīng)誘導(dǎo)后得到了胰島素分泌細(xì)胞。胰島樣細(xì)胞經(jīng)糖尿病大鼠尾靜脈移植入體內(nèi)2周后, 糖尿病大鼠空腹血糖濃度明顯下降, 說明胰島樣細(xì)胞分泌的胰島素迅速發(fā)揮了降血糖的作用, 胰島樣細(xì)胞移植可以治療糖尿病。這種HUCB-MSCs移植入糖尿病大鼠體內(nèi)發(fā)揮降血糖作用的優(yōu)化條件和維持時間將成為今后研究的重點。

［1］ Erices A, Conget P, Minguell JJ.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.Br J Haematol, 2000, 109(1):235-242.

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［9］ 于瑾, 王啟偉, 陳昭烈.間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島β細(xì)胞的研究進(jìn)展.中國生物工程雜志, 2005, 25(8):6-9.

Inducing human umbilical cord blood mesenchymal stem cells into insulin secreting cells in vitro culture and its effects on diabetes rats

WANG Ying, LUO Hao-hong, GAO Hong-quan, et al. Medical College of Xiamen, Xiamen 361008, China

Objective To explore the possibility of inducing the differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells(HUCB-MSCs) into insulin secreting cells in vitro and the therapeutic efficacy on diabetic rats following transplantation.Methods We isolated and cultured HUCB-MSCs, and induced HUCBMSCs to differentiate into insulin secreting cells in the islet cell culture condition.HUCB-MSCs of induction were detected by immunocytochemical Methods.Zinchydronium was detected by Dithizon staining.Transplantation efficiency of islet-like cells was detected.Results Under induction, immunocytochemical examination showed that the expression of human insulin was positive.Dithizon stain showed that the cytoplasm of HUCB-MSCs was stained in brownish red color after induction.At 2 weeks following transplantation, blood glucose concentration in the islet-like cell group significantly reduced.Conclusion HUCB-MSCs can be differentiated into insulin secreting cells in vitro.HUCB-MSCs have the potential to become an excellent candidate in β cell replacement therapy of typeⅠdiabetes.

Human umbilical cord blood; Mesenchymal stem cells; Induction; Diabetes rats

2014-03-19］

廈門市科技計劃項目(廈門市衛(wèi)生局資助)(項目編號：3502Z20089029)

361008 廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校(王英 羅浩虹高洪泉)；廈門市中山醫(yī)院(繆智輝)；廈門市中醫(yī)院(趙亞清)