劉榮榮彭 敏馬宏博△

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

·研究報(bào)告·

加味清營顆粒對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型炎性因子的影響*

劉榮榮1彭 敏2馬宏博2△

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

目的 觀察加味清營顆粒對(duì)急性肺損炎性因子的影響。方法 144只wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，加味清營顆粒低、中、高劑量組，地塞米松組，每組24只，連續(xù)灌胃6 d，尾靜脈注射LPS（5 mg/kg）后于1，3，5 h不同時(shí)相處死大鼠。采用ELISA法檢測肺泡灌洗液（BALF）中炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-10的含量變化；用Bradford檢測BALF蛋白含量；HE染色觀察病理切片。結(jié)果 模型組各時(shí)相炎癥因子均明顯高于其他各組；與模型組比較，各治療組均可顯著降低的炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α、IL-10的表達(dá)（P<0.05）；與地塞米松組比較，加味清營顆粒低、中、高劑量組在1 h、3 h時(shí)相降低IL-1β、TNF-α的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組相比較，各治療組均可顯著降低的BALF蛋白的表達(dá)（P<0.05）；與地塞米松組比較，加味清營顆粒各時(shí)相劑量組在降低BALF蛋白的表達(dá)方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；肺組織HE染色病理結(jié)果示肺泡結(jié)構(gòu)破壞或?qū)嵶儯闻莞粼龊耧@著，毛細(xì)血管充血明顯，肺泡腔內(nèi)、細(xì)動(dòng)脈周圍和細(xì)支氣管壁可見成堆炎癥細(xì)胞浸潤，而加味清營顆粒各劑量組肺組織病理均有較大程度的改善。結(jié)論 加味清營顆?？山档图毙苑螕p傷時(shí)炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-10的釋放，降低BALF中蛋白的含量，從而減輕肺部炎癥細(xì)胞浸潤，對(duì)損傷的肺組織起到修復(fù)保護(hù)的作用。

加味清營顆粒 急性肺損傷 炎癥介質(zhì)

急性肺損傷是全身炎癥反應(yīng)綜合征在肺部的表現(xiàn)，是嚴(yán)重創(chuàng)傷或感染后出現(xiàn)最早及發(fā)生率最高的并發(fā)癥之一。本實(shí)驗(yàn)通過觀察加味清營顆粒對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷大鼠肺組織中炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-10表達(dá)的影響，及肺泡灌洗液（BALF）中蛋白的含量和肺組織病理切片變化，觀察其對(duì)內(nèi)毒素性急性肺損傷的治療效果，指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 加味清營顆粒由水牛角、地黃、金銀花、連翹、玄參、黃連、麥冬、竹葉、丹參、西洋參、大黃組成，藥品采用三九醫(yī)藥生產(chǎn)的配方顆粒，購自于山東省立醫(yī)院中藥房。地塞米松注射液（鄭州卓峰制藥有限公司，每支5 mg，批號(hào)H41020055）；脂多糖（美國Sigma公司，O55：B5）。ELISA檢測試劑盒（Invitrogen）

1.2 動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性wistar大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.3 造模與分組 將144只大鼠隨機(jī)分為6組，空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，加味清營顆粒低、中、高劑量組，地塞米松組，每組24只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始灌胃，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組每日每次予生理鹽水2 mL灌胃，加味清營顆粒低、中、高劑量組每日分別給予

1.2 、1.8、2.4 g/100 g體質(zhì)量，地塞米松組每日給2.5 mg/ 100 g體質(zhì)量灌胃。灌胃6 d后，除空白對(duì)照組向大鼠尾靜脈靜推生理鹽水2.5 mL/kg外，其余各組向大鼠尾靜脈靜推內(nèi)毒素5 mg/kg。后放回籠中自由活動(dòng)及飲食，觀察各組呼吸變化情況。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 以上各組分別于注射LPS后 1、3、5 h，10%水合氯醛麻醉處死大鼠，開胸取肺，每次用2 mL生理鹽水灌洗左肺，共3次，合并3次收集到的BALF-20℃凍存待測。采用ELISA法檢測BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10的變化；用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）檢測BALF中蛋白含量；取右肺上葉，制作石蠟切片，行HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（s）表示，組間差異采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，組內(nèi)對(duì)比采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10的水平 見表1～3。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10含量明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠BALF中 IL-1β、TNF-α、IL-10水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與地塞米松組比較，加味清營顆粒各組在1、3 h時(shí)相炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α、IL-10均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），在5 h時(shí)相無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組BALF中IL-1β的含量變化（pg/mL，s）

表1 各組BALF中IL-1β的含量變化（pg/mL，s）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與地塞米松組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。下同。

組別n 5 h空白對(duì)照組 8 17.49±0.16模型組 8 36.285±0.85**中藥低劑量組 8 30.54±2.02**△△1 h 3 h 18.12±0.22 19.68±1.03 35.86±0.21**37.93±3.55**27.17±1.19**△△29.06±1.78**△△中藥中劑量組 8 27.62±1.04**△△25.34±1.37**△△＃26.27±0.45**△△##中藥高劑量組 8 22.27±1.09**△△＃24.59±2.36**△△##25.97±1.64**△△地塞米松組 8 30.70±4.11**△28.09±0.82**△△28.44±3.47**△△

表2 各組BALF中TNF-α的含量變化（pg/mL，s）

表2 各組BALF中TNF-α的含量變化（pg/mL，s）

組別n 5 h空白對(duì)照組 8 162.98±33.71模型組 8 283.99±1.30**中藥低劑量組 8 221.46±19.42*△△1 h 3 h 143.22±5.29 166.31±29.75 296.06±6.37**292.63±5.35**219.48±5.77**△△##230.30±11.56**△△#中藥中劑量組 8 224.84±2.67*△△214.49±15.98**△△##220.11±8.59**△△##中藥高劑量組 8 209.28±19.16**△△##217.04±7.01*△△##229.99±30.67*△地塞米松組 8 261.20±13.07**△△248.84±7.03**△△224.84±4.60*△△

表3 各組BALF中IL-10的含量變化（pg/mL，s）

表3 各組BALF中IL-10的含量變化（pg/mL，s）

組別n 5 h空白對(duì)照組 8 30.47±0.59模型組 8 57.72±1.27**中藥低劑量組 8 53.09±4.49**△1 h 3 h 31.43±0.35 29.76±0.80 55.98±1.58**58.35±2.25**43.60±0.94**△△##48.94±4.42**△△中藥中劑量組 8 45.17±0.47**△△36.18±0.76**△△##46.07±5.48**△△中藥高劑量組 8 34.13±0.78**△△##41.85±2.88**△△47.60±5.66**△△地塞米松組 8 48.94±1.20**△△47.71±6.03**△△50.90±4.87**△

2.2 大鼠BALF中蛋白含量的變化 見表4。除空白對(duì)照組以外，各組的BALF蛋白水平均有升高；與模型組比較，各治療組蛋白含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；加味清營顆粒低、中劑量組蛋白升高值明顯低于地塞米松組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），高劑量組與地塞米松組比較無明顯差異 （P＞0.05）。

2.3 病理形態(tài)學(xué)的變化 光鏡下見空白對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，無水腫，肺泡隔未見增厚，偶可見少量炎癥細(xì)胞浸潤（見圖1～3）。模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞或?qū)嵶儯闻莞粼龊耧@著，毛細(xì)血管充血明顯，肺泡腔內(nèi)、細(xì)動(dòng)脈周圍和細(xì)支氣管壁可見成堆炎癥細(xì)胞浸潤和大量紅細(xì)胞滲出，炎癥細(xì)胞主要以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，其中病理損傷以5 h最為明顯（見圖1～3）。各用藥組亦存在肺泡結(jié)構(gòu)破壞或?qū)嵶?、肺泡隔增厚、毛?xì)血管充血、肺泡腔內(nèi)、細(xì)動(dòng)脈周圍和細(xì)支氣管壁可見成堆炎癥細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出情況，但均較模型組有較大程度的改善。光鏡下觀察加味清營顆粒各組炎癥變化均比地塞米松組炎癥輕。

表4 各組BALF中蛋白含量變化（μg/mL，s）

表4 各組BALF中蛋白含量變化（μg/mL，s）

組別n 5 h空白對(duì)照組 8 1.72±0.10模型組 8 14.28±1.59**中藥低劑量組 8 8.52±2.23**△△##1 h 3 h 1.03±0.35 1.45±0.08 8.90±1.57**11.69±1.16**5.07±1.22**△△##6.60±1.17**△△##中藥中劑量組 8 6.85±1.10**△△##4.38±0.65**△△##5.36±0.86**△△##中藥高劑量組 8 2.68±0.56**△△3.25±0.36**△△4.25±0.90**△△地塞米松組 8 2.61±0.43**△△3.35±0.46**△△3.63±0.44**△△

圖1 各組1 h時(shí)HE染色（100倍）

3 討 論

圖2 各組3 h時(shí)HE染色（100倍）

圖3 各組5 h時(shí)HE染色（100倍）

急性肺損傷是由感染、大面積肺栓塞、外傷等多種因素所致急性肺部損傷［1-2］。免疫反應(yīng)失衡是引起危重患者死亡的重要因素，其中過度炎癥反應(yīng)是危重癥患者機(jī)體免疫反應(yīng)失衡的重要環(huán)節(jié)［3-4］。急性肺損傷發(fā)病的關(guān)鍵是致病因子激活多種炎癥細(xì)胞，釋放一系列炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)可再度激活炎癥細(xì)胞，以“自分泌”或“旁分泌”的方式釋放更多的炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子，導(dǎo)致瀑布式的炎癥反應(yīng)，形成肺過度損傷［5］。肺組織細(xì)胞中IL-1β、TNF-α的過量表達(dá)參與介導(dǎo)了急性肺損傷的發(fā)生［6］。其中IL-10是一種重要的抑制性細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體的免疫功能和炎癥過程具有重要的調(diào)節(jié)活性。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10能通過廣泛抑制 IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，參與體內(nèi)內(nèi)毒素介導(dǎo)的TNF-α負(fù)反饋調(diào)節(jié)［7-8］。

內(nèi)毒素類似于中醫(yī)學(xué)的“熱毒”，其造成急性肺損傷的臨床表現(xiàn)類似于中醫(yī)的溫病。根據(jù)溫病衛(wèi)氣營血辨證施治原則，大多數(shù)醫(yī)家選用清熱解毒、活血化瘀、通里攻下、益氣固脫法等方法治療急性肺損傷。筆者認(rèn)為內(nèi)毒素所致之急性肺損傷，乃邪熱內(nèi)傳營分，耗傷營陰所致，遵《素問·至真要大論》“熱淫于內(nèi)，治以咸寒，佐以甘苦”之旨，治宜咸寒清營解毒為主，輔以透熱養(yǎng)陰。清營湯出自于《溫病條辨》，是治療溫病熱入營血分的經(jīng)典方。而加味清營顆粒系在清營湯基礎(chǔ)上加用大黃、西洋參。方中苦咸寒之水牛角清解營分之熱毒，為君藥。熱傷營陰，又以生地黃涼血滋陰、麥冬清熱養(yǎng)陰生津、玄參滋陰降火解毒，諸藥共用，既可甘寒養(yǎng)陰保津，又可助君藥清營涼血解毒，共為臣藥。君臣相配，咸寒與甘寒并用，清營熱而滋營陰，祛邪扶正兼顧。溫邪初入營分，故用銀花、連翹、竹葉清熱解毒，輕清透泄，使?fàn)I分熱邪有外達(dá)之機(jī)，促其透出氣分而解，此即“入營猶可透熱轉(zhuǎn)氣”之具體應(yīng)用；黃連苦寒，清心解毒；丹參清熱涼血，并能活血散瘀，可防熱與血結(jié)；由于熱病傷陰，配伍西洋參能夠清熱養(yǎng)陰，益氣生津，現(xiàn)代藥理研究表明西洋參具有提高機(jī)體免疫力，抗缺氧，能夠降低血液凝固性、抑制血小板凝聚等作用；大黃清熱瀉火，涼血解毒，現(xiàn)代藥理研究表明，大黃具有抗炎、解熱、抑制非特異性免疫功能等作用。上述7味均為佐藥。本方的配伍特點(diǎn)是以清營解毒為主，配以養(yǎng)陰生津和“透熱轉(zhuǎn)氣”，使入營之邪透出氣分而解，諸癥自愈。既往研究表明西洋參、大黃組成的扶正排毒液［9］對(duì)內(nèi)毒素休克肺損傷具有保護(hù)作用，二者可抑制TNF-α和IL-10的過度分泌，調(diào)整感染狀態(tài)下的免疫紊亂、炎癥與抗炎失衡，降低重要臟器的損害。

本研究通過尾靜脈注射脂多糖制作大鼠內(nèi)毒素急性肺損傷模型，觀測不同時(shí)間點(diǎn)BALF中炎癥因子的變化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，各用藥組均能夠顯著降低炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α、IL-10的釋放，提示加味清營顆?？梢种艻L-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，其中5 h以內(nèi)加味清營顆粒高劑量組效果尤為明顯；病理切片顯示在各時(shí)間段加味清營顆粒均可有效控制炎癥反應(yīng)。由上所述，可以看出加味清營顆粒可減輕炎癥的“級(jí)聯(lián)式”反應(yīng)，進(jìn)而減輕肺組織損傷，阻止炎癥的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)肺組織有保護(hù)作用。其具體的抗炎保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ Blank R，Napolitano LM.Epidemiology of ARDS and ALI［J］. Crit Care Clin，2011，27（3）：439-435.

［2］ Vadasz I，Sznajder JI.Update in acute lung injury and critical care 2010［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，183（9）：1147-1152.

［3］ de Gonzalo-Calvo D，Neitzert K，F(xiàn)ernandez M，et al.Differential inflammatory responses in aging and disease：TNF-alpha and IL-6 as possible biomarkees［J］.Free Radio Biol Med，2010，49（5）：733-738.

［4］ Calder PC.The 2008 ESPEN sir david cuthbertson lecture：fatty acids and inflammatory from the membrane to the nucleus and the laboratory bench to the clinic［J］.Clin Nutr，2010，29（1）：5-12.

［5］ 李玉梅，衛(wèi)洪昌．ALI／ARDS抗炎治療研究的策略與展望［J］．中國病理生理雜志，2009，25（4）：813-816．

［6］ Abraham E.NF-Kappa B activation［J］.Crit Care Med，2000，28（4 Suppl）：100-104.

［7］ Ward PA，Lentsch AB.Endogenous regulation of the acute inflammatory response［J］.Mol Cell Biochem，2002，234-235（1-2）：225-228.

［8］ Chen ZT，Li SL，Cai EQ，et al.LPS induces puimonary intravascular macrophages producing inflammatory mediators via activating NF-kappaB［J］.J Cell Biochem，2003，89（6）：1206-1214.

［9］ 馬宏博，劉清泉，姜良鐸，等．扶正排毒液對(duì)內(nèi)毒素休克肺損傷家兔支氣管肺泡灌洗液和血清細(xì)胞因子含量的影響［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2005，12（6）：369-372.

Effects of Modified Qingying Granule on Inflammatory Mediator Induced by Lipopolysaccharide in Rat Model with Acute Lung Injury

LIU Rongrong1，PENG Min2，MA Hongbo2. 1 Shandong Traditional Chinese Medicine University，Shandong，Jinan 250014，China；2 Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Shandong，Jinan 250014，China

Objective：To investigate the effect of Modified Qingying Granule on inflammatory mediator of acute lung injury.Methods：144 Wistar rats were randomly divided into blank control group，model group，Modified Qingying Granule low dose group，medium dose group and high dose group，and dexamethasone group（n=24）. Continuous intragastric administration lasted 6 days.After tail vein injection of LPS（5 mg/kg），rats were executed at 1st，3rd，and 5th hour later.ELISA was used to detect the content changes of inflammatory mediators such as IL-1β，TNF-α and IL-10 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）.BALF protein was examined by Bradford.The pathological section was made into HE stainining.Results：Inflammatory cytokines at different time points of model group were significantly higher than those in the other groups.Compared with model group，expressions of inflammatory mediators of treatment groups decreased（P<0.05）.Compared with dexamethasone group，Modified Qingying Granule low，midium and high dose groups at 1 h and 3 th hour had statistical significance in reducing IL-1β and TNF-α expressions（P<0.05）.Compared with model group，expression of BALF protein in treatment groups significantly decreased（P<0.05）.Compared with dexamethasone group，Modified Qingying Granule had statistical significance in reducing BALF protein expression（P<0.05）.Lung tissue HE staining pathological results revealed damaged or changed alveolar structure，thickened alveolar septa，capillary congestion，and visible piles of inflammatory cell infiltration in alveolar space，around arteriole and in bronchiolar wall.Modified Qingying Granule groups had a greater degree of improvement in lung tissue pathology.Conclusion：Modified Qingying Granule can reduce the expressions of inflammatory mediators such as IL-1β and TNF-α，increase expression of IL-10，reduce the content of bronchoalveolar lavage fluid protein，so as to reduce the pulmonary inflammatory cellinfiltration and to repair the protective function of damaged lung tissue.

Modified Qingying Granule；Acute lung injury；Inflammatory mediator

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1964-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.002

2014-08-14）

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81202675）；山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（ZR2011HQ052）

△通信作者