姜爭 劉彥龍 王錫山

USP家族，即泛素化特異性蛋白酶家族，通過去除共軛復(fù)合物中的泛素，進(jìn)而調(diào)節(jié)一系列的細(xì)胞機(jī)制，包括前植入、生長和分化、細(xì)胞周期進(jìn)展、腫瘤形成、轉(zhuǎn)錄活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[1-2]。該家族是目前已知的去泛素化酶中成員最多，且結(jié)構(gòu)最具多樣性的一類。這些酶分子都含有兩個短而保守的片段即賴氨酸盒和組氨酸盒，序列中具有起催化作用的三聯(lián)殘基，即半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺，能將泛素分子從大的蛋白上移除[3]。這些USP基因或為腫瘤抑制基因或為致癌基因來行使截然不同的生長調(diào)節(jié)功能。

USP22作為一種新型的去泛素化水解酶廣泛表達(dá)于各種成年組織中，中等表達(dá)于心臟和骨骼肌，弱表達(dá)于肺臟、肝臟和胚胎的早期[4]。通過聯(lián)合檢測USP22及11-Polycomb癌癥干細(xì)胞信號中的其它基因，可以預(yù)測腫瘤是否具有侵略性和耐藥性等特點(diǎn)，使癌癥患者的診斷和病情級別的劃分成為可能，并且發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞如表達(dá)這種信號則會獲得轉(zhuǎn)移促使-失巢凋亡抑制-非整倍體-異常細(xì)胞周期控制的干細(xì)胞樣表型。為了驗證這種觀點(diǎn)，我們在本文中詳細(xì)探討USP22在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

資料與方法

一、一般方法

選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院2001至2003年手術(shù)切除的192例結(jié)直腸癌患者的存檔蠟塊作為實驗對象，包括正常粘膜27例、腺瘤27例、腺癌192例、肝轉(zhuǎn)移灶15例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶22例。其中正常粘膜、腺瘤、腺癌均取自同一患者，轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶相配對。對全部蠟塊重新切片，行HE染色，由兩位高年資病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)查。同時收集研究病例的臨床病理資料。

二、實驗方法

抗USP22抗體(Ⅰ抗)購自Abcam公司，為濃縮型兔抗人單克隆抗體；抗Ki-67抗體(I抗)購自Santa Cruz公司，為濃縮型鼠抗人單克隆抗體；PV免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

(一)免疫組化方法

載玻片經(jīng)1 ∶10稀釋的多聚賴氨酸涂片處理，4 μm石蠟連續(xù)切片。將石蠟組織切片以60℃烤60 min，常規(guī)脫蠟、水化。用新鮮配制的3% H2O2清除內(nèi)源性過氧化氫酶。抗原修復(fù)，滴加4%BSA封閉非特異性抗原；將多余液體甩凈后滴加1:200稀釋的I抗，30℃溫箱中孵育2小時后置于4℃冰箱內(nèi)過夜；30℃溫箱中復(fù)溫2 h。PBS沖洗后加羊抗兔、抗鼠二抗工作液，30℃溫箱孵育60 min；PBS洗后加三抗工作液，30℃溫箱中孵育60 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精上行脫水、二甲苯透明。中性樹膠封片后鏡檢。本實驗采用PBS代替一抗做為抗體對照。

(二)免疫組化評定方法

USP22蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核，表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色或棕褐色顆粒。陰性對照為同一批次樣品，不加一抗。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照[5]如下的評分方法：光學(xué)顯微鏡下觀察組織標(biāo)本的著色程度，高倍鏡下(10×40)隨機(jī)取4個不同視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及核陽性細(xì)胞數(shù)，按陽性細(xì)胞所占的百分比計分：0為陰性表達(dá)；1+為弱陽性，陽性細(xì)胞數(shù)為1～10%；2+為陽性細(xì)胞11～50%；3+為陽性細(xì)胞≥50%。以陽性細(xì)胞數(shù)≥10%定為USP22陽性表達(dá)。以上結(jié)果至少由2位病理科醫(yī)生在雙盲情況下觀察確定。

(三)統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。USP22的表達(dá)量與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系，正常粘膜、腺瘤、腺癌及轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)的比較分別應(yīng)用卡方檢驗和t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中USP22的表達(dá)量逐步上調(diào)

USP22除表達(dá)于少量的炎性淋巴細(xì)胞外，主要表達(dá)于結(jié)直腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖1)。通過統(tǒng)計分析，USP22的表達(dá)量逐步升高，其中USP22在腺癌中的表達(dá)均明顯高于正常粘膜(P<0.0001)和腺瘤(P=0.006)，但USP22在正常粘膜與腺瘤的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.192)

二、在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中USP22的表達(dá)量逐步上調(diào)

與原發(fā)灶比較，USP22在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)升高無差異(P=0.052)，在肝轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)則顯著升高(P=0.021，圖2)。

三、USP22的表達(dá)與臨床病理資料相關(guān)性分析結(jié)果

在192例原發(fā)灶中，104例(54.16%)呈陽性表達(dá)。USP22 的表達(dá)與患者的性別(χ2=4.642，P=0.031)、腫瘤大小(χ2=9.067，P=0.003)、浸潤深度(χ2=22.543，P<0.0001)、淋巴結(jié)狀態(tài)(χ2=8.066，P=0.005)及 Ki-67 的表達(dá)(χ2=37.829，P<0.0001)高度相關(guān)，而與患者的年齡、腫瘤部位無相關(guān)性(表1)。

注：a圖為USP22在細(xì)胞核中組織免疫化學(xué)染色圖像；b圖為USP22在淋巴細(xì)胞中組織免疫化學(xué)染色圖像

注：a圖為在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中USP22在原發(fā)灶中免疫組織化學(xué)染色圖像；b圖為在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中USP22在轉(zhuǎn)移灶中免疫組織化學(xué)染色圖像

表1 USP22表達(dá)與臨床病理因素相關(guān)性分析情況表

變量數(shù)量USP22陰性USP22陽性P值年齡(歲) <6010347560.952 ≥60894148性別 男11244680.031 女804436腫瘤部位 結(jié)腸7631450.301 直腸1165759腫瘤大小(cm) <57645310.003 ≥51164373浸潤深度 T1-31046440<0.0001 T4882464淋巴結(jié)受累程度 N011261510.005 N1-2802753Ki-67表達(dá) 陰性695217<0.0001 陽性1233687

討 論

USP22作為一種新型的去泛素化水解酶廣泛表達(dá)于各種成年組織，如中等表達(dá)于心臟、骨骼肌，弱表達(dá)于肺臟、肝臟和胚胎的早期[4]。通過聯(lián)合檢測USP22及11-Polycomb/癌癥干細(xì)胞信號中的其它基因，可以預(yù)測腫瘤是否具有侵略性和耐藥性等特點(diǎn)，使癌癥患者的診斷和病情級別的劃分成為可能，并且發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞如表達(dá)這種信號則會獲得轉(zhuǎn)移促使-失巢調(diào)亡抑制-非整倍體-異常細(xì)胞周期控制的干細(xì)胞樣表型。為了驗證這種觀點(diǎn)，我們重點(diǎn)論述了USP22在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中及其在指導(dǎo)預(yù)后方面的作用。

我們通過免疫組化檢測USP22在粘膜、腺瘤、腺癌及其轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，USP22的表達(dá)量逐步升高。與粘膜和腺瘤相比，USP22在癌灶中的表達(dá)量最高，這說明致癌基因USP22的活化狀態(tài)會促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。而且，與原發(fā)灶相比較，USP22在肝轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)顯著增高。這說明USP22的表達(dá)升高會促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，尤其是肝轉(zhuǎn)移，這也支持PcG通路的活化可能介導(dǎo)實體瘤轉(zhuǎn)移這一假設(shè)[6]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)USP22與Ki-67的表達(dá)高度相關(guān)，這說明高表達(dá)USP22的腫瘤細(xì)胞其增殖能力強(qiáng)，這也同樣符合Polycomb/癌癥干細(xì)胞信號可以準(zhǔn)確預(yù)測惡性腫瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)的假設(shè)[7]，USP22編碼的蛋白是一種酶，容易受到藥物的影響，可能會成為抗腫瘤藥物的理想靶點(diǎn)。

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