胡繼衛(wèi), 孫志國, 馬 杰, 張景華, 張順禮, 李文建

(河北省唐山市人民醫(yī)院 乳腺科, 河北 唐山, 063001)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，死亡率僅次于肺癌，對女性健康構(gòu)成了極大威脅[1-2]。乳腺癌的發(fā)生是一個復(fù)雜、多因素、多步驟的病理生理過程，主要涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。本研究通過免疫組織化學(xué)SP法檢測原癌基因Bmi-1與抑癌基因P16蛋白的表達(dá)情況，并進(jìn)一步研究二者與臨床生物學(xué)指標(biāo)ER、PR、HER-2的關(guān)系，探討B(tài)mi-1與P16蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及臨床意義，為乳腺癌靶向基因提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇本院2009年1月—2011年7月病例資料齊全的女性乳腺癌患者標(biāo)本80例，年齡22～85歲，中位年齡48歲。其中，年齡<45歲38例，≥45歲42例；腫瘤直徑≤2 cm 26例，2～5 cm 28例，>5 cm 26例；對癌組織進(jìn)行組織學(xué)分級：Ⅰ級38例，Ⅱ級26例，Ⅲ級16例；根據(jù)國際抗癌協(xié)會乳腺癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ期38例。80例乳腺癌中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例, ER陽性者47例, PR陽性者44例，HER-2陽性者42例。另取癌旁組織(距癌組織≥5 cm、組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常)20例為對照組。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及內(nèi)分泌治療。

1.2 方法

1.2.1 Bmi-1表達(dá)檢測: ① 試劑：兔抗人Bmi-1單克隆抗體(Bmil：D2087XpTM Rabbit mAb)辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗分別由美國Cell signaling公司和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；DAB顯色試劑盒和抗小鼠/兔SABC免疫組化試劑盒分別購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司和武漢博士德生物工程有限公司; ② 免疫組織化學(xué)染色步驟：所有5 μm石蠟組織標(biāo)本切片后，采用二甲苯常規(guī)脫蠟和梯度酒精水化，使用3%過氧化氫封閉10 min, 滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，應(yīng)用0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液在pH6.0行15 min微波抗原修復(fù)。5%BSA封閉20 min, 滴加一抗Bmi-1(1∶100)4 ℃, 過夜培養(yǎng)。第2天，分別滴加山羊抗兔二抗和SABC, 在室溫下培養(yǎng)20 min, PBS充分洗滌, DAB顯色。蘇木精復(fù)染、脫水、使透明、封片鏡檢。用PBS緩沖液代替一抗做空白對照。

1.2.2 p16蛋白表達(dá)檢測： 免疫組織化學(xué)染色步驟：將5 μm石蠟切片置于65 ℃烤箱中，過夜孵育，二甲苯脫蠟。梯度乙醇脫水，自來水沖洗5 min, 蒸餾水沖洗2遍。采用pH6.0的檸檬酸溶液進(jìn)行抗原修復(fù)。加入100 μL一抗，室溫下孵育1 h, PBS緩沖液沖洗3次。去掉PBS液后，每張切片再加入100 μL二抗(即用型MaxVision)，在室溫下孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3次。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水、干燥、烘干，用樹膠封片，在顯微鏡下讀片。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用半定量計分法判定[4]，隨機觀察10個高倍視野(×400)后評價結(jié)果，腫瘤細(xì)胞按染色強度分為4等: 0分為無染色; 1分為淺黃色; 2分為棕黃色; 3分為棕褐色。按照腫瘤陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)分為5組: 0分，無著色; 1分，≤10%; 2分, 11%～50%; 3分, 51%～75%; 4分≥75%。ER、PR、HER-2為本院病理科常規(guī)檢測方法與判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用t檢驗。P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bmi-1、p16在乳腺癌組織中的表達(dá)

Bmi-1、p16主要位于細(xì)胞核或胞漿內(nèi)，陽性表達(dá)者可見棕黃色或棕褐色顆粒(見圖1中B、C)。本研究還顯示: Bmi-1在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為68.75%(55/80), 而p16蛋白在乳腺癌組織中陽性表達(dá)率僅為55.00%(44/80)，結(jié)果顯示, Bmi-1蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常乳腺組織, p16的陽性表達(dá)顯著低于正常對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Bmi-1、p16 蛋白陽性表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

Bmi-1蛋白在乳腺癌組織學(xué)分級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級中的表達(dá)率分別為52.63%、73.08%、100.00%, 在臨床Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ期中，表達(dá)率分別為45.23%、94.74%, 在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中，表達(dá)率分別為47.62%和92.11%, 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 但Bmi-1與患者年齡、腫瘤大小、ER、PR、HER-2均無相關(guān)性(P>0.05)。而p16蛋白在組織學(xué)分級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級中的表達(dá)率分別為73.68%、53.85%、12.50%, 在臨床Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ期中，表達(dá)率分別為78.57%、28.95%, 在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)率為26.32%和80.95%, 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); p16的表達(dá)與HER-2顯著相關(guān)(P<0.05)，但與患者年齡、腫瘤大小、ER、PR無相關(guān)性(P>0.05), 見表1。

A: 乳腺癌組織HE染色; B: Bmi-1在乳腺癌組織中的陽性表達(dá); C: P16在乳腺癌組織中的弱陽性表達(dá); D: HER-2陽性在乳腺癌組織中的表達(dá)。

表1 乳腺癌組織中Bmi-1蛋白陽性表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

臨床病理參數(shù)Bmi-1n陽性pP16n陽性p腫瘤直徑/cm≤2 cm2620(76.92)2610(38.46)2～5 cm2818(64.29)>0.052813(46.43)>0.05≥5 cm2617(65.38)2611(43.31)年齡/歲≥453824(63.16)>0.053820(52.63)>0.05<454231(80.95)4224(57.14)組織學(xué)分級Ⅰ級3820(52.63)3828(73.68)Ⅱ級2619(73.08)<0.012614(53.85)<0.01Ⅲ級1616(100.00)162(12.50)臨床分期Ⅰ～Ⅱ期4219(45.23)<0.014233(78.57)<0.01Ⅲ期3836(94.74)3811(28.95)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無4220(47.62)<0.014234(80.95)<0.01有3835(92.11)3810(26.32)ER表達(dá)+4733(70.21)>0.054728(59.57)>0.05-3322(66.67)3316(48.48)PR表達(dá)+4430(68.18)>0.054424(54.55)>0.05-3625(69.44)3620(55.56)HER-2表達(dá)+4228(66.67)>0.054214(33.33)<0.01-3827(71.05)3830(78.95)

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有57萬例乳腺癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。乳腺癌的治療主要以手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療為主的綜合治療。部分早期乳腺癌患者，也會發(fā)生隱匿性轉(zhuǎn)移[4]。乳腺癌的發(fā)生是一個復(fù)雜、多因素、多步驟的病理生理過程，主要涉及癌基因的激活與抑癌基因的失活。乳腺癌標(biāo)志物雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、癌基因(HER-2)一定程度上可反映其生物學(xué)行為[5-6]。本研究通過免疫組織化學(xué)SP法檢測乳腺癌組織中Bmi-1與P16蛋白的表達(dá)情況，并探討二者與上述標(biāo)志物的關(guān)系，以闡明Bmi-1與P16蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及臨床意義，為后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

Bmi-1基因是Polycomb基因(PcG)家族的重要成員，可以作為一種原癌基因，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn), Bmi-1在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，其促進(jìn)腫瘤發(fā)生的可能機制為：Bmi-1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核與染色質(zhì)結(jié)合，通過抑制其下游INK4a，減少INK4a-p16對cyclinD-CDK4的抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)腫瘤增殖；同時通過抑制p19-ARF，增加MDM-2的活性，減少細(xì)胞的凋亡[9]。目前，國內(nèi)外關(guān)于Bmi-1與乳腺癌ER、PR、HER-2關(guān)系的研究鮮有報道。本實驗通過免疫組織化學(xué)SP法檢測80例乳腺癌組織和20例正常乳腺組織中Bmi-1蛋白的表達(dá)及其與臨床生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系[10-12], 結(jié)果表明, Bmi-1蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與其組織學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；但Bmi-1與患者年齡、腫瘤大小、ER、PR、HER-2均無關(guān)[13-14]。因此本研究認(rèn)為, Bmi-1蛋白促進(jìn)了乳腺癌增殖，并在乳腺癌晚期發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移的過程中可能起重要作用[15-16]。p16基因是細(xì)胞周期依賴激酶家族抑制蛋白(CKIs)成員之一，可編碼一個由148個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在限制點(R點)與D型細(xì)胞周期蛋白(cyclinD1)競爭性結(jié)合CDK4/CDK6，抑制CDK4/CDK6的作用，降低Rb蛋白磷酸化水平，從而阻止細(xì)胞通過限制點R點由G1期進(jìn)入S期。因此，當(dāng)p16蛋白不能正常表達(dá)時，會導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖，進(jìn)一步引起腫瘤的發(fā)生[17-18]。

本研究結(jié)果提示：與正常乳腺組織相比, p16蛋白在乳腺癌組織中低表達(dá)，說明p16蛋白的缺失表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn), p16蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)；與HER-2顯著相關(guān)(P<0.05), 但與患者年齡、腫瘤大小、ER、PR無關(guān)。本實驗通過聯(lián)合檢測Bmi-1、p16在乳腺癌中的表達(dá)情況，結(jié)果證實：此2種蛋白在乳腺癌中的表達(dá)與組織學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且p16表達(dá)與靶基因HER-2表達(dá)顯著相關(guān)。因此，Bmi-1、p16及HER-2的聯(lián)合靶向治療，有望成為乳腺癌治療的新方法。然而，Bmi-1、p16是否能夠作為新的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，還需要進(jìn)一步的深入研究。

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