雷 鳴, 朱祖健

(江蘇建康職業(yè)學(xué)院解剖學(xué)教研室, 江蘇 南京, 210029)

長期大劑量注射D-半乳糖由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腦衰老的動物模型，是國內(nèi)較公認(rèn)的研究，但其具體機(jī)制尚不明確[1]。研究[2]表明，很多因素參與了D-半乳糖誘導(dǎo)腦衰老的過程，包括鈣穩(wěn)態(tài)、鈉鉀ATP酶活性[3]和膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)[4]等，但對線粒體，尤其是腦線粒體形態(tài)和功能的詳細(xì)研究較少。線粒體是細(xì)胞能量代謝中心，腦線粒體的結(jié)構(gòu)和功能對于維持神經(jīng)元的正常功能起著重要作用。研究表明，腦衰老的發(fā)生發(fā)展過程腦線粒體的形態(tài)和功能均出現(xiàn)異常[5]。線粒體呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成的主要部位，同時也是ROS損傷作用的靶器官。線粒體呼吸鏈功能損傷又會在ATP合成過程中產(chǎn)生更多的ROS, 此惡性循環(huán)加劇了衰老及其相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)程[6]。因此，腦線粒體功能障礙可能是此動物模型的發(fā)病機(jī)制之一。本實驗選擇D-半乳糖制備動物模型，通過檢測腦線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性，以及電鏡觀察海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變，以探討腦線粒體的形態(tài)和功能在D-半乳糖誘導(dǎo)腦衰老中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物分組及模型制作：健康的雄性C57BL/6小鼠20只(南京醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)，體質(zhì)量26～28 g。動物隨機(jī)分為2組: ① D-半乳糖注射組，小鼠10只，按文獻(xiàn)[4]方法造模復(fù)制小鼠衰老模型，腹腔注射D-半乳糖100 mg/(kg·d), 持續(xù)6周; ② 對照組，小鼠10只，腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)6周。D-半乳糖購于武漢博士德公司，線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性定量檢測試劑盒由南京建成生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 腦線粒體提取：小鼠斷頭處死，快速取腦，制備10%腦組織勻漿。4 ℃, 4 000 r/min離心15 min, 棄除上清，充分混懸沉淀。4 ℃, 10 000 r/min離心10 min, 所得沉淀為線粒體?？捡R斯亮藍(lán)法定量線粒體蛋白濃度。

1.2.2 腦線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的檢測：腦線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均參照商品化試劑盒說明書進(jìn)行實驗，結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.3 電鏡標(biāo)本的制作和觀察：透射電鏡標(biāo)本的制作按常規(guī)流程進(jìn)行[4], 在JEM1200電鏡下觀察海馬CA1區(qū)線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 腦線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性

與對照組相比, D-半乳糖組腦線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性均顯著降低(表1)。

表1 腦線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性

2.2 海馬區(qū)腦線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變

對照組腦線粒體呈橢圓形或圓形，其內(nèi)嵴清晰可見，基質(zhì)均勻(圖1A)。D-半乳糖組腦線粒體的病理改變主要有: ① 線粒體的體積腫脹增大，嵴變短、減少或消失; ② 線粒體變性，主要為水變性，基質(zhì)稀薄，可見空泡(圖1B)。這些變性的線粒體除在既往報道的海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中分布外[7], 還存在于突觸密集區(qū)及星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起中(圖1C)和腦毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足中(圖1D)。

A. 對照組 40000倍; B. D-半乳糖組 40000倍; C. D-半乳糖組突觸密集區(qū) 25000倍; D. D-半乳糖組毛細(xì)血管區(qū) 25000倍

3 討 論

目前，D-半乳糖模型已成為國內(nèi)較公認(rèn)的研究由氧化應(yīng)激導(dǎo)致衰老的模型。本實驗研究結(jié)果證實，腦線粒體形態(tài)和功能障礙參與了此動物模型的發(fā)病機(jī)制。較之既往僅在外周組織(如肝臟[8]、心肌[9])中探討此模型上的線粒體損傷，本結(jié)果拓展了D-半乳糖研究的領(lǐng)域。結(jié)合以往和本實驗結(jié)果推測，D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是腦線粒體形態(tài)和功能障礙的一個重要因素。

線粒體呼吸鏈?zhǔn)钱a(chǎn)生ROS的主要場所, ROS主要來源于呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ位點的超氧化陰離子的歧化。正常情況下下，線粒體內(nèi)的多種抗氧化系統(tǒng)，諸如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白等可維持其內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)[10]。然而在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，線粒體也是ROS損傷的敏感靶標(biāo)，過多的ROS會攻擊線粒體呼吸鏈復(fù)合物，導(dǎo)致電子滲漏大量增加以及ATP水平的下降，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)失活、脂質(zhì)過氧化和mtDNA突變等，從而導(dǎo)致線粒體的功能異常，促進(jìn)衰老和疾病的發(fā)生[11]。本實驗也發(fā)現(xiàn)，模型組腦線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性下降。

在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步調(diào)查海馬CA1區(qū)腦線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變：模型組中腫脹扭曲、嵴斷裂和空泡樣變的變性線粒體廣泛分布在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，神經(jīng)元內(nèi)線粒體的形態(tài)異常與功能障礙將對細(xì)胞產(chǎn)生一系列不利影響，如神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙、突觸傳導(dǎo)受阻等，從而導(dǎo)致此模型中廣泛報道的認(rèn)知和學(xué)習(xí)障礙。同時進(jìn)一步觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞突起內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷：星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)產(chǎn)生的主要場所，而GSH作為腦中抗ROS的主要物質(zhì)之一，能有效阻止其產(chǎn)生，保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激的損傷[12]。但由于GSH的合成是一個典型的需要ATP酶的反應(yīng)過程，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷將擾亂GSH的正常代謝[13]。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的變性會降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗氧化能力，加重衰老及衰老相關(guān)疾病的發(fā)病進(jìn)程。

綜上所述，本實驗證實腦線粒體形態(tài)異常和呼吸鏈復(fù)合物活性下降參與了D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對神經(jīng)元的損傷，因此，應(yīng)用特異性保護(hù)腦線粒體的藥物可能有助于延緩腦衰老的發(fā)生發(fā)展。

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