韓志剛, 俞婷婷, 申紅麗, 阿力木江·賽提瓦爾地

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肺內(nèi)一科, 新疆 烏魯木齊, 830011)

作為一個極有潛力的肺腺癌診斷標(biāo)志物，Napsin-A是天門冬氨酸蛋白酶家族中的新成員，可在異常增生的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、原發(fā)性肺腺癌和極少部分大細(xì)胞癌中表達(dá)[1-2]。表皮生長因子受體(EGFR)具有酪氨酸激酶活性，為原癌基因e-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物。研究[3]表明，EGFR在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、大腸癌及乳腺癌組織中均過度表達(dá)。本研究通過分析NSCLC組織中Napsin-A表達(dá)與EGFR基因的關(guān)系，來探討Napsin-A在腫瘤形成過程中的作用，以期為NSCLC的臨床診斷、治療及預(yù)后評估提供幫助，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年6—12月本院收治的經(jīng)病理確診并取得組織標(biāo)本的NSCLC 89例，其中腺癌53例，鱗癌36例。所有患者的血紅蛋白、肝腎功能和心電圖檢查均正常，既往均未接受過放療、化療，無其他惡性腫瘤病史及心腦血管疾病。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：兔抗人Napsin-A多克隆抗體、SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測：全部組織標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，連續(xù)4張, 60 ℃恒溫箱中烘烤20 min, 脫蠟水化。采用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加一抗, 4 ℃冰箱過夜；滴加二抗，沖洗后DAB染色；蘇木素復(fù)染、脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，試劑生產(chǎn)公司提供的切片作為陽性對照。

1.2.3 EGFR基因檢測：將提取的DNA稀釋成2 ng/μL, 取出陽性質(zhì)控品和Taq酶(EGFR29), 陽性質(zhì)控品先解凍，再振蕩混勻，兩者快速離心15 s待用；分別向45 μL待測樣品DNA、5 μL陽性質(zhì)控品(STD)和45 μL超純水中加入2.25 μL Taq酶(EGFR29)，渦旋器上混勻15 s后再快速離心15 s; 在PCR管冰架上輕輕揭開8聯(lián)PCR管反應(yīng)條條蓋，將混好的DNA和Taq酶樣品依次取5 μL加入8管中，然后小心蓋上條蓋；離心8連管反應(yīng)條，將其放入熒光實(shí)時PCR儀(StatageneMX3000PTM)。

設(shè)置PCR參數(shù)第一階段: 95 ℃ 5 min, 1個循環(huán)；第二階段: 95 ℃ 25 s, 64 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 15個循環(huán)；第三階段: 93 ℃ 25 s, 60 ℃ 35 s, 72 ℃ 20 s, 15個循環(huán)，信號收集。第三階段60 ℃收集FAM和HEX信號。保存文件，執(zhí)行實(shí)時PCR，約90 min完成檢測。

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn)

采用盲法，由2位病理科主治醫(yī)生于光鏡下分別對Napsin-A結(jié)果進(jìn)行評定。若有意見分歧，則由2位醫(yī)生共同閱片決定。Napsin-A主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜呈棕色顆粒狀染色為標(biāo)準(zhǔn)，觀察5個視野(×200)，分別計數(shù)100個細(xì)胞，以陽性細(xì)胞<5%為陰性，≥5%為陽性。

2 結(jié)果

2.1 Napsin-A在NSCLC組織中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，Napsin-A在NSCLC組織中主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，陽性著色位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色、顆粒狀及彌漫性分布；在腺癌和鱗癌組織中的陽性率分別為96.2%(51/53)和5.6%(2/36), 兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。見圖1、2。

圖1 Napsin-A在腺癌組織中的表達(dá) 100倍

圖2 Napsin-A在鱗癌組織中的表達(dá) 100倍

2.2 Napsin-A表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

Napsin-A在NSCLC不同臨床分期、組織分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3 Napsin-A在NSCLC組織中的表達(dá)及其與EGFR的關(guān)系

腺癌組織中, EGFR基因突變率為54.7%(29/53), 而Napsin-A表達(dá)陽性者的突變率高達(dá)100%; 鱗癌組織中, EGFR基因突變率為5.6%, 而Napsin-A表達(dá)陽性者的突變率為50.0%。兩者Napsin-A表達(dá)陽性者突變率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表1 Napsin-A表達(dá)與NSCLC臨床病理的關(guān)系[n(%)]

表2 Napsin-A在NSCLC組織中的表達(dá)及其與EGFR的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

中國居民死因調(diào)查結(jié)果顯示，近20年來，肺癌死亡率增加了近1.5倍，是增長最快的惡性腫瘤[4]。肺腺癌是最常見的肺癌組織學(xué)類型，發(fā)病率呈上升趨勢。研究[5]表明，Napsin-A可能是提示肺腺癌患者預(yù)后較好的標(biāo)記物。Napsin-A對原發(fā)性肺腺癌具有極高的特異性，即高分化腺癌表達(dá)最強(qiáng)，中分化腺癌表達(dá)較弱，低分化腺癌表達(dá)最弱[6]。易瑞沙和特羅凱是近年來開發(fā)的2種特異性較高的治療NSCLC的腫瘤靶向治療藥物，能通過抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中必需的EGFR絡(luò)氨酸激酶活性而阻斷腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。但兩者療效存在很大個體差異，僅有25%～35%患者能取得很好的療效[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，EGFR基因絡(luò)氨酸激酶區(qū)域存在多種突變，其中以19號外顯子內(nèi)缺失突變以及21號外顯子L858R最為常見，這些突變能很好地預(yù)測易瑞沙和特羅凱的治療效果，為腫瘤用藥提供指導(dǎo)依據(jù)。但EGFR基因檢測費(fèi)用較高，在新疆多數(shù)醫(yī)保不能報銷，且新疆地處邊遠(yuǎn)，經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)，許多患者因經(jīng)費(fèi)困難拒絕行基因檢測，這就在一定程度上限制了靶向藥物的使用，使多數(shù)患者錯失了靶向藥物治療的最佳時機(jī)。本研究結(jié)果顯示，Napsin-A在腺癌和鱗癌組織中的陽性率分別為96.2%和5.6%, 可見Napsin-A在肺腺癌組織中的表達(dá)率較高。腺癌組織中EGFR基因突變率為54.7%，而鱗癌組織中僅為5.6%, 說明腺癌組織中EGFR基因突變率也相對較高。無論在腺癌還是鱗癌組織中，Napsin-A表達(dá)陽性者EGFR基因突變率均較高，但腺癌組織明顯高于鱗癌組織。

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