孫佩光， 奚如春， 李俊成， 歐陽昆唏， 鐘燕梅， 陳曉陽

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 ?？趯嶒炚?海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 ?？?570102； 2 華南農(nóng)業(yè)大學 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/廣東省森林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642； 3 華南農(nóng)業(yè)大學 林學院，廣東 廣州 510642)

25個油茶優(yōu)良無性系的遺傳分析與分子鑒別

孫佩光1,2， 奚如春2,3， 李俊成2,3， 歐陽昆唏2,3， 鐘燕梅2,3， 陳曉陽2,3

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 ?？趯嶒炚?海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 ?？?570102； 2 華南農(nóng)業(yè)大學 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/廣東省森林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642； 3 華南農(nóng)業(yè)大學 林學院，廣東 廣州 510642)

【目的】為油茶種質資源的合理利用奠定理論基礎，為油茶優(yōu)良品種資源保護提供技術支持.【方法】采用SRAP分子標記對來源于江西省的25個油茶優(yōu)良無性系進行遺傳分析與分子鑒別.【結果和結論】11對SRAP引物組合共擴增出347個位點，其中多態(tài)性位點332個，多態(tài)性位點占比為95.68%.聚類分析結果表明，25個油茶優(yōu)良無性系的遺傳距離介于0.255 6～0.738 4，平均遺傳距離為0.599 9，表明這些油茶無性系的地理來源相近.在遺傳距離為0.528 0處，可以將25個油茶優(yōu)良無性系分為5組.利用篩選出的引物構建了25個油茶優(yōu)良無性系的DNA指紋圖譜，每一對引物構建的指紋圖譜均可以用于25個優(yōu)良無性系的分子鑒別.

油茶； 優(yōu)良無性系； SRAP； 遺傳分析； 分子鑒別

油茶Camelliaoleifera是我國南方重要的木本油料樹種，在生態(tài)經(jīng)濟建設中占有重要地位.近年來，在國家相關政策引導和支持下，我國的油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速.但對于有些油茶邊緣產(chǎn)區(qū)，由于未選育出油茶優(yōu)良栽培品種，引進其他省區(qū)選育的并通過國家審定的優(yōu)良品種成為促進本地區(qū)油茶產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的一個重要途徑.隨著各地區(qū)對油茶良種苗木需求的不斷增加，油茶良種苗木市場在出現(xiàn)供不應求的同時，也出現(xiàn)了品系混雜、以假亂真現(xiàn)象.

分子標記技術為油茶的品種鑒定和遺傳多樣性評價提供了有力的工具.其中RAPD (Random amplified polymorphic DNA)[1-3]、ISSR(Inter-simple sequence repeat polymorphism)[4-7]和SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)[8-13]標記技術已經(jīng)成功應用于油茶種質資源遺傳多樣性評價、親緣關系分析以及品種指紋圖譜構建等方面的研究.油茶是重要的經(jīng)濟林樹種之一，對其種質資源遺傳多樣性評價和DNA指紋圖譜構建等方面的研究是基礎理論研究與實際應用的橋梁，也是未來油茶關鍵基因定位、分子標記輔助育種等許多應用研究的理論依據(jù)和基礎.本文從分子水平探討了25個油茶優(yōu)良無性系的遺傳關系，構建了25個油茶優(yōu)良無性系的DNA指紋圖譜，本研究將為油茶種質資源的合理利用奠定基礎，為油茶優(yōu)良品種資源的保護提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為來源于江西省的25個油茶優(yōu)良無性系品種，試驗材料保存于廣東省林業(yè)科學研究院2007年營建的油茶種質資源收集圃，采樣母樹已進入投產(chǎn)期，樹體生長健康，林分管理良好.25個優(yōu)良無性系的主要經(jīng)濟性狀參見奚如春等[14]和左繼林等[15]相關文獻.本試驗于2012年4月開始，分別采集25個油茶優(yōu)良無性系品種幼嫩枝條上的飽滿嫩芽及嫩葉5～7片，標記后置于冰壺中帶回實驗室提取DNA.

1.2 試驗儀器與試劑

試驗儀器主要有：PCR儀(EDC-810型，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，離心機(5810R型，Eppendorf)，電泳儀(CZ- 20 F型，北京市六一儀器廠)，Eppendorf各量程移液器等.試驗用dNTP，10×PCR buffer，TaqDNA聚合酶及100 bp DNA Ladder marker 等購自廣州瑞真科技生物有限公司，瓊脂糖和Gold View核酸染料購自廣州鼎國生物科技有限公司，SRAP引物由上海生工合成，本研究所用引物序列見表1.

表1 本研究使用的SRAP引物序列

1.3 油茶DNA提取和SRAP-PCR擴增

使用TIANGEN DNA secure plant kit(離心柱型, DP320-03)進行油茶總DNA提取.油茶SRAP體系建立和優(yōu)化參見孫佩光等[16]文獻.使用六一儀器公司電泳儀(CZ- 20 F型)對PCR產(chǎn)物進行聚丙烯凝膠電泳，電泳時樣品進樣量為7 μL，加樣后先用300 V低壓電泳30 min，待樣品全部進入聚丙烯凝膠后改用1 500 V恒壓電泳3 h，硝酸銀染色，氫氧化鈉顯色，待膠板干燥后用數(shù)碼照相機拍照.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

假定來自同一位點的同一等位基因在凝膠上遷移位置是相同的，根據(jù)電泳圖片電泳條帶的有無，將同一位置有擴增條帶的標記為“1”，無條帶的則標記為“0”，按照此方法對所有圖片進行判讀，結果形成0/1矩陣，使用NTSYS-pc2.10e軟件計算遺傳距離和相似系數(shù)，使用非加權平均法(UPGMA)進行聚類.

2 結果與分析

2.1 SRAP擴增多態(tài)性條帶統(tǒng)計

本研究采用11對SRAP引物對25個油茶優(yōu)良無性系進行了擴增，分析結果見表2.由表2可知，引物擴增條帶多數(shù)集中在100～1 500 bp之間，11個引物組合共擴增到347個條帶，其中多態(tài)性條帶為332條，多態(tài)性條帶占比為95.68%.11個引物組合擴增條帶數(shù)為23～40條，其中多態(tài)性條帶數(shù)為22～38條.引物組合Me9/Em17擴增條帶最少，為23條，多態(tài)性條帶為23條；引物組合Me6/Em16擴增條帶最多為40條，其中多態(tài)性條帶為38條；平均每個引物擴增條帶數(shù)為31.55條，平均每個引物擴增的多態(tài)性條帶為30.18條，總體而言，引物多態(tài)性比率較高.

表2 引物擴增總條帶與多態(tài)性條帶統(tǒng)計

2.2 25個油茶優(yōu)良無性系的聚類分析

根據(jù)SRAP標記分析結果，將25個油茶優(yōu)良無性系進行聚類，從聚類分析結果(圖1)可知，在遺傳距離為0.528 0時，可以將25個油茶優(yōu)良無性系分為5組：第1組包括贛永5、贛興48、贛興46和贛無15等4個油茶優(yōu)良無性系；第2組包括贛永6、贛撫20、贛無2、贛無1等4個油茶優(yōu)良無性系；第3組包括贛石84-3、贛石84- 8、贛55、贛6、贛無11、贛48、贛83-1、贛8、贛無16、贛83- 4、贛68、贛70、贛190、贛447等14個油茶優(yōu)良無性系；第4組只包括贛71這1個油茶優(yōu)良無性系；第5組包括贛無12和贛無24等2個油茶優(yōu)良無性系.

從聚類結果可知，贛無11和贛48這2個油茶優(yōu)良無性系的遺傳距離最近，為0.256，表明這2個油茶優(yōu)良無性系具有較近的親緣關系.雖然兩者在鮮出籽率、干出籽率、種仁含油量等性狀上相差不大，但是這2個無性系在每平方米產(chǎn)油量、干出仁率、鮮果含油率、單位冠幅產(chǎn)油量等經(jīng)濟性狀間存在較大差異[14-15]，這說明SRAP揭示的親緣關系與經(jīng)濟性狀存在一定差異.

圖1 25個優(yōu)良無性系的UPGMA聚類圖Fig.1 Genetic clustering of 25 superior clones by UPGMA

以第1組為例，分析SRAP聚類結果與經(jīng)濟性狀聚類的差異.第1組包含贛永5、贛興48、贛興46、贛無15等4個無性系品種，其中贛永5和贛興48這2個無性系品種在每平方米產(chǎn)油量、干出籽率、干出仁率以及鮮果含油率等性狀上都比較接近，贛永5和贛興48這2個無性系的單位冠幅產(chǎn)油量分別為995.4和1 148.7 kg/hm2，也比較接近，這2個無性系品種在遺傳距離為0.463處聚在一起.贛興46和贛無15這2個無性系品種在每平方米產(chǎn)油量、鮮出籽率、干出籽率、干出仁率、種仁含油量及鮮果含油量等性狀上都比較接近[14-15]，這2個無性系品種在遺傳距離為0.443處聚在一起，這表明SRAP分子標記揭示的親緣關系在一定程度上與經(jīng)濟性狀相吻合.綜上所述，SRAP分子標記在一定程度上揭示了油茶優(yōu)良無性系品種間的差異和親緣關系，SRAP分子聚類結果與經(jīng)濟性狀的聚類結果存在一致性，但又存在一定差異，這也說明油茶遺傳背景比較復雜.

2.3 25個優(yōu)良品種的指紋圖譜構建與分子鑒別

隨機選擇引物組合Me6/Em22的擴增圖譜為例(圖2)，根據(jù)相同分子量位置上條帶的有無，按照擴增圖譜分子量從大到小排列，對擴增條帶進行記錄，形成0/1矩陣，構建25個油茶優(yōu)良無性系的DNA指紋圖譜(表3).由表3可知，25個油茶優(yōu)良無性系品種的指紋圖譜各不相同，說明各個無性系品種間在分子水平上存在明顯差異，以此可以對25個油茶優(yōu)良無性系進行分子鑒別.

1：贛永5；2：贛永6；3：贛興46；4：贛興48；5：贛撫20；6：贛無1；7：贛無2；8：贛無11；9：贛無12；10：贛無15；11：贛無24；12：贛83-1；13：贛83- 4；14：贛石84-3；15：贛石84- 8；16：贛6；17：贛8；18：贛無16；19：贛48；20：贛55；21：贛68；22：贛70；23：贛71；24：贛190；25：贛447；M：DNA marker.

圖2 Me6/Em22引物組合對25個優(yōu)良無性系的擴增結果
Fig.2 Amplification of 25 superior clones by Me6/Em22 primer combinations

在進行油茶優(yōu)良無性系的分子鑒別時，可以分3個步驟進行.首先，構建各油茶優(yōu)良無性系品種的標準DNA指紋圖譜，即用一定數(shù)量的SRAP引物組合對各油茶主產(chǎn)區(qū)的油茶優(yōu)良無性系品種進行SRAP-PCR擴增和聚丙烯凝膠電泳，以構建一定數(shù)量引物組合組成的油茶優(yōu)良無性系品種的標準DNA指紋圖譜庫；其次，對市場上一些可疑苗木進行鑒定時，嚴格按照本試驗操作流程，采取待檢測苗木的葉片，使用相同的試驗方法進行DNA提取，利用建庫的若干個引物組合對待檢測苗木進行SRAP-PCR擴增，并對PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯凝膠電泳；最后，將可疑苗木的指紋圖譜與油茶優(yōu)良無性系品種標準DNA指紋圖譜庫進行比對，就可以快速判定待檢測苗木是否為標準DNA圖譜庫中的某一無性系品種，從而實現(xiàn)可疑苗木的快速、準確檢測與鑒定.

目前油茶優(yōu)良無性系的苗木繁育多采用芽苗砧接的方法進行，嫁接苗與母本在分子水平上具有相同的DNA遺傳特性，因此利用該方法進行油茶無性系的品種鑒定是可行的.當然，在計算機技術普及的今天，完全可以借助計算機技術實現(xiàn)待檢測苗木的指紋圖譜、電泳圖譜與油茶優(yōu)良無性系品種標準DNA指紋圖譜、電泳圖譜的快速準確比對工作.

表3 25個油茶優(yōu)良無性系的DNA指紋圖譜1)Tab.3 DNA fingerprinting of 25 superior clones of Camellia oleifera

1)表中的25個油茶優(yōu)良無性系品種的DNA指紋圖譜依據(jù)引物組合Me6/Em22的擴增結果構建.

3 討論與結論

本研究使用11對SRAP引物組合對25個來源于江西省的油茶優(yōu)良無性系進行了擴增，共檢測到347個位點，其中332個為多態(tài)性位點，多態(tài)性位點的占比高達95.68%，說明這25個油茶優(yōu)良無性系群體存在豐富的遺傳變異.林萍等[8]、左雪枝等[12]也證實SRAP分子標記能夠揭示油茶群體較高的遺傳多樣性.由于研究群體、分子標記種類、試驗方法等方面的差異，關于油茶遺傳多樣性的研究結果不盡相同.張云[3]使用19條RAPD引物對福建省的42份油茶材料進行擴增，共擴增出159個條帶，其中94個為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶占比為59.12%.黃永芳等[2]使用18條RAPD引物對90個來源于湖南、廣西等省的油茶優(yōu)良無性系進行擴增，共擴增出593條譜帶，其中564條為多態(tài)性譜帶，多態(tài)性譜帶占比為95.11%.一些學者利用ISSR標記評價油茶遺傳多樣性時發(fā)現(xiàn)，ISSR引物擴增條帶數(shù)目為3～24條，多態(tài)性條帶占比介于68.6%～92.56%[4-5,7].彭紹鋒等[9]、韓欣等[11]利用SRAP標記的8對引物組合對14個油茶優(yōu)良品種進行了擴增，共擴增出65個條帶，其中多態(tài)性條帶22個，多態(tài)性條帶占比為33.85%，這與本研究結果相差較大.本文和林萍等[8]的研究均采用聚丙烯凝膠電泳分析，而彭紹鋒等[9]使用的是瓊脂糖電泳分析，可能是由于瓊脂糖凝膠的分辨率較低，從而導致多態(tài)性條帶比例較低.

利用SRAP分子標記在遺傳距離為0.528 0處，可以將25個油茶優(yōu)良無性系分為5組，SRAP聚類結果在某些品種間表現(xiàn)出一致性，但總體來說SRAP聚類結果表明各無性系品種未聚成具有規(guī)律性的大類，王保明等[5]和溫強等[6]的研究也得出相似結論.一方面說明油茶群體的遺傳背景比較復雜，SRAP標記可能與這些經(jīng)濟性狀間的關聯(lián)程度不大；另一方面可能由于油茶長期的異花授粉，導致油茶群體內遺傳分化嚴重，存在較高的遺傳多樣性.本研究的25個油茶優(yōu)良無性系的遺傳距離介于0.255 6～0.738 4之間，平均遺傳距離為0.599 9，說明這些油茶的地理來源較近.實際上，這些油茶優(yōu)良無性系是江西省林科所的科研工作者從江西省境內油茶群體中選育出的平均單位冠幅產(chǎn)油量都超過750 kg/hm2的高產(chǎn)油茶優(yōu)良無性系品種[15,17].

本研究利用篩選出的11對SRAP引物組合構建了25個油茶優(yōu)良無性系的DNA指紋圖譜，可以實現(xiàn)25個油茶優(yōu)良無性系的分子鑒別.張國武等[4]利用ISSR標記形成的0/1矩陣數(shù)據(jù)可以將10個油茶優(yōu)良無性系鑒別，溫強等[6]指出利用ISSR標記形成的0/1矩陣數(shù)據(jù)可以一次性鑒別19～25個優(yōu)良無性系，不同引物間互相搭配可以實現(xiàn)25個優(yōu)良無性系的鑒別.王保明等[5]利用ISSR引物形成的0/1矩陣可以有效鑒別湖南省的23個油茶優(yōu)良無性系.林萍等[8]篩選出13對SRAP引物組合，每一個引物組合都可以將長林系列的12個油茶優(yōu)良無性系進行鑒別，此外還找到了某些優(yōu)良無性系的特異性條帶.筆者篩選出11對SRAP引物組合，利用每一對引物組合的0/1數(shù)據(jù)矩陣都可以實現(xiàn)25個油茶優(yōu)良無性系的有效鑒別.在研究過程中我們也發(fā)現(xiàn)了一些品種的特異性條帶，但由于特異性條帶的數(shù)目較少，利用價值非常有限.在使用SRAP標記對油茶優(yōu)良品種鑒定時，由于SRAP標記提供的信息量非常豐富，若僅選用某些品種的特異性條帶對油茶優(yōu)良無性系進行分子鑒別，無疑舍棄了大量有用的信息，容易出現(xiàn)誤判的現(xiàn)象.將待檢測苗木的DNA指紋圖譜、電泳圖譜與油茶優(yōu)良無性系的標準DNA指紋圖譜庫、電泳圖譜庫相比對，可以充分利用SRAP標記提供的豐富的信息，準確判斷待測苗木是否為某一油茶優(yōu)良無性系品種，通過進一步的優(yōu)化，這些比對工作完全可以借助計算機軟件瞬間完成，這也是未來油茶品種鑒別和品種審定的發(fā)展趨勢.

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【責任編輯李曉卉】

Geneticanalysesandmolecularidentificationof25superiorclonesofCamelliaoleifera

SUN Peiguang1,2, XI Ruchun2,3, Li Juncheng2,3, OUYANG Kunxi2,3, ZHONG Yanmei2,3, CHEN Xiaoyang2,3

(1 Haikou Experimental Station, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Provincial Key Laboratory for Genetics and Breeding of Banana, Haikou 570102, China; 2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources/Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3 College of Forestry, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】This study aimed to lay a theoretical foundation for rational use ofCamelliaoleiferagermplasm resource and provide technical support for the conservation of eliteC.oleiferavarieties.【Method】SRAP molecular markers were used to assess the genetic diversity and molecular identification of 25 superior clones ofC.oleiferafrom Jiangxi Province.【Result and conclusion】Three hundred ard forty seven sites were amplified by 11 primer combinations of SRAP, among which 332 were polymorphic sites.The percentage of polymorphic sites was 95.68%.The result of cluster analysis indicated that the genetic distance of the 25 superior clones ranged from 0.255 6 to 0.738 4, and the average genetic distance was 0.599 9, indicating that these cultivars had similar geographical origins.The 25 superior clones were divided into five groups by cluster analysis according to genetic distance 0.528 0.DNA fingerprints of the 25 superior clones were constructed using the screened primer combinations.The fingerprint constructed by each primer combination can be used for molecular identification of the 25 superior clones.

Camelliaoleifera; superior clone; SRAP; genetic analysis; molecular identification

2013- 08- 02優(yōu)先出版時間2014- 09- 30

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.06.016.html

孫佩光(1980—)，男，助理研究員，博士,E-mail:sunpeiguang888@sina.com; 通信作者：陳曉陽(1958—)，男，教授，博士，E-mail：xychen@scau.edu.cn

廣東省自然科學基金團隊項目 (9351064201000002)；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新專項(2012KJCX011-02)

孫佩光， 奚如春， 李俊成，等.25個油茶優(yōu)良無性系的遺傳分析與分子鑒別[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014,35(6):83- 88.

S727.32

A

1001- 411X(2014)06- 0083- 06