齊元富 李慧杰 顏 芹

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濟(jì)南 250011)

納米雄黃對(duì)皮膚鱗癌A431細(xì)胞p53、Bcl-2表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制探討※

齊元富 李慧杰 顏 芹

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濟(jì)南 250011)

目的探討納米雄黃對(duì)皮膚鱗癌A431細(xì)胞p53、Bcl-2表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。方法通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)、免疫組化法觀察納米雄黃干預(yù)p53、Bcl-2在人皮膚鱗癌A431細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果各濃度納米雄黃干預(yù)組、注射用順鉑(DDP)干預(yù)組及聯(lián)合用藥組的Bcl-2陽(yáng)性率均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；隨著納米雄黃濃度的升高，Bcl-2陽(yáng)性率也明顯降低(P<0.05)；聯(lián)合用藥組的Bcl-2陽(yáng)性率明顯低于各濃度納米雄黃干預(yù)組和DDP干預(yù)組(P<0.05)。各濃度納米雄黃干預(yù)組、DDP干預(yù)組及聯(lián)合用藥組的p53的相對(duì)灰度值(RATIO)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；隨著納米雄黃濃度的升高，p53的RATIO明顯升高(P<0.05)；聯(lián)合用藥組的p53的RATIO明顯高于各濃度納米雄黃干預(yù)組和DDP干預(yù)組(P<0.05)。各濃度納米雄黃干預(yù)組條帶灰度高于對(duì)照組；5%、10%、20%納米雄黃干預(yù)組條帶亮度依次變大；聯(lián)合用藥組條帶亮度較DDP干預(yù)組、各濃度納米雄黃干預(yù)組大，內(nèi)參β-actin見(jiàn)不到肉眼可見(jiàn)的濃度變化。結(jié)論納米雄黃可上調(diào)p53表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)，與DDP聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用，可能是納米雄黃誘導(dǎo)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

癌，鱗狀細(xì)胞；皮膚腫瘤；雄黃；藥理學(xué)；細(xì)胞凋亡

近年來(lái)，皮膚癌發(fā)病率逐年上升，由于其侵襲性和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，越來(lái)越受到人們的重視。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，皮膚為人之藩籬，容易受到外邪侵襲，外感六淫，風(fēng)毒燥熱之邪久羈留戀，內(nèi)耗陰血，奪精灼液，或濕毒久留，皆可變生惡瘡，發(fā)為本病。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)皮膚癌的病因尚未完全明了，認(rèn)為其發(fā)生可能與過(guò)度的日光曝曬、放射線(xiàn)、砷劑、焦油衍化物等長(zhǎng)期刺激有關(guān)，具體機(jī)制則有待進(jìn)一步探討[1]。雄黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是外用治療疥瘡的要藥，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為雄黃具有抗腫瘤效應(yīng)，多用于皮膚癌、子宮頸癌等多種癌癥的治療[2]。而雄黃納米化后作用更顯著，本研究旨在觀察納米雄黃對(duì)皮膚鱗癌A431細(xì)胞p53、Bcl-2表達(dá)的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)。

1.2 主要試劑藥品 DMEM高糖培養(yǎng)基[賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司]；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；兔抗人Bcl-2單克隆抗體、濃縮型鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(博士德生物工程有限公司)；總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；p53介導(dǎo)Wip1上下游引物及內(nèi)參基因β-actin由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司(廣州)合成(Wip1上游引物：5'-AAGAAACTGGCGGAATGGC-3'，下游引物：5'-CCAA GAACCA CCCCTGAGTC-3'，分子量：131 bp；內(nèi)參基因β-action上游引物序列為5'-GCATGGG TCAGAAGGATTCCT-3'，下游引物序列為5'-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3'，片斷長(zhǎng)度為106 bp)；注射用順鉑(DDP，齊魯制藥有限公司)。

1.3 主要儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱BB5060UV型(德國(guó)Heraeus公司)；超凈工作臺(tái)ClassⅡ2085型[美國(guó)(熱電)Thermo Forma公司]；倒置相差顯微鏡1X50S8F型(日本Olympus公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)2200型(美國(guó)阿爾法科技公司)；T-Gradient梯度PCR儀(德國(guó)BIOMETRA公司)；PCR儀Sprint型(美國(guó)Thermo Hybaid公司)。

1.4 納米雄黃制備 雄黃原藥購(gòu)自陜西康惠制藥股份有限公司(批號(hào)：091201)，后由山東龍脈科技發(fā)展有限公司龍脈精研機(jī)(LVM-80WE型)研磨納米化，再于濟(jì)南微納顆粒技術(shù)有限公司W(wǎng)inner801光子相關(guān)納米激光粒度分析儀測(cè)定納米雄黃顆粒尺寸大小和粒徑分布，平均粒徑約72.79 nm，符合納米藥物制劑要求。納米雄黃用氯化鉀(KCl)飽和硝酸溶液溶解，氫氧化鈉(NaOH)調(diào)pH至7.0，磷酸鹽緩沖液(PBS)定容，配成 2 mg/mL的混懸液，過(guò)濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 ①對(duì)照組：含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；②納米雄黃干預(yù)組：設(shè)置5%、10%、20%納米雄黃3個(gè)濃度水平；③DDP干預(yù)組：DDP終濃度為2 g/mL；④聯(lián)合用藥組：10%納米雄黃+DDP。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及其懸液制備 將人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中、37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)貼壁，即可傳代，一般3 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。制備細(xì)胞懸液時(shí)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株，經(jīng)0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)后細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)制備待用。

1.7 免疫組化法測(cè)定 將經(jīng)過(guò)高溫消毒的蓋玻片放入六孔板中，取A431細(xì)胞懸液接種于內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞爬滿(mǎn)玻片后棄液，按實(shí)驗(yàn)分組加藥，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄液PBS清洗，95%乙醇固定30 min，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚室溫孵育15 min，3%雙氧水室溫孵育，封閉血清室溫孵育，一抗工作液濕盒37 ℃孵育60 min，PBS清洗，二抗工作液濕盒37 ℃孵育30 min，PBS清洗，SABC濕盒37 ℃孵育30 min，DAB染色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，自來(lái)水洗滌泛藍(lán)，梯度酒精脫水，加二甲苯，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察，HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析。光學(xué)顯微鏡下，選擇免疫組化玻片陽(yáng)性細(xì)胞(陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿、胞核、胞膜，為棕黃色顆粒)較集中的區(qū)域采集3～5個(gè)光鏡視野輸入到HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)內(nèi)，在相同的背底倍體條件下選擇相應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)完全定量分析。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè) 提取總RNA：將A431細(xì)胞懸液接種于六孔板，繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛貼壁后棄液，按實(shí)驗(yàn)分組加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，經(jīng)0.25%胰蛋白酶液制成細(xì)胞懸液，分別裝入離心管，400 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，按總RNA提取試劑盒操作步驟提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)ND-1000檢測(cè)RNA的純度與含量用于RT-PCR檢測(cè)，具體參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。用凝膠成像系統(tǒng)自帶的分析軟件分析各目的條帶和內(nèi)參的平均密度值，即灰度值(IDV)。相對(duì)灰度值(RATIO)(%)=目的條帶的IDV/內(nèi)參的IDV×100%。

3)通過(guò)在軟件系統(tǒng)平臺(tái)和技術(shù)架構(gòu)中融入GIS，可保證大數(shù)據(jù)分析過(guò)程的可視化和分析結(jié)果時(shí)空位置動(dòng)態(tài)展示的可操作性和實(shí)用性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化法檢測(cè)納米雄黃對(duì)A431細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。

組 別陽(yáng)性率(%)對(duì)照組76．80±1．045%納米雄黃干預(yù)組66．98±1．95?○10%納米雄黃干預(yù)組60．22±0．85?△○20%納米雄黃干預(yù)組55．24±1．16?△#○DDP干預(yù)組44．28±0．77?○聯(lián)合用藥組27．47±0．62?

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與5%納米雄黃干預(yù)組比較，△P<0.05；與10%納米雄黃干預(yù)組比較，#P<0.05；與聯(lián)合用藥組比較，○P<0.05

由表1可見(jiàn)，各濃度納米雄黃干預(yù)組、DDP干預(yù)組及聯(lián)合用藥組的Bcl-2陽(yáng)性率均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；隨著納米雄黃濃度的升高，Bcl-2陽(yáng)性率也明顯降低(P<0.05)；聯(lián)合用藥組的Bcl-2陽(yáng)性率明顯低于各濃度納米雄黃干預(yù)組和DDP干預(yù)組(P<0.05)。

2.2 RT-PCR法檢測(cè)納米雄黃對(duì)A431細(xì)胞p53介導(dǎo)Wip1mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)表2。

組 別RATIO(%)對(duì)照組16．25±2．315%納米雄黃干預(yù)組22．78±4．21?○10%納米雄黃干預(yù)組29．60±2．85?△○20%納米雄黃干預(yù)組38．61±2．44?△#○DDP干預(yù)組56．81±5．54?○聯(lián)合用藥組69．25±2．83?

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與5%納米雄黃干預(yù)組比較，△P<0.05；與10%納米雄黃干預(yù)組比較，#P<0.05；與聯(lián)合用藥組比較，○P<0.05

由表2可見(jiàn)，各濃度納米雄黃干預(yù)組、DDP干預(yù)組及聯(lián)合用藥組的p53的RATIO均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；隨著納米雄黃濃度的升高，p53的RATIO明顯升高(P<0.05)；聯(lián)合用藥組的p53的RATIO明顯高于各濃度納米雄黃干預(yù)組和DDP干預(yù)組(P<0.05)。

2.3 p53介導(dǎo)Wip1mRNA的RT-PCR圖 各濃度納米雄黃干預(yù)組條帶灰度高于對(duì)照組；5%、10%、20%納米雄黃干預(yù)組條帶亮度依次變大；聯(lián)合用藥組條帶亮度較DDP干預(yù)組、各濃度納米雄黃干預(yù)組大，內(nèi)參β-actin見(jiàn)不到肉眼可見(jiàn)的濃度變化。見(jiàn)封3，圖1。

3 討 論

皮膚癌的發(fā)生是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間、多因素、多階段的復(fù)雜過(guò)程。皮膚鱗癌位置淺表，易于操作，臨床治療方法較多，主要有手術(shù)治療、放射治療、激光和冷凍治療、藥物治療等，由于各種方法的適應(yīng)證各不相同，因此其治愈率和復(fù)發(fā)率也不盡相同[3]。對(duì)于某些不適于接受外科手術(shù)治療或術(shù)后需預(yù)防復(fù)發(fā)的病例，研究有效的抗腫瘤藥物意義重大。雄黃的應(yīng)用歷史悠久，主要活性化學(xué)成分為四硫化四砷(As4S4)，其可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞DNA合成，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能等多種因素發(fā)揮抗腫瘤作用，而納米雄黃相對(duì)普通雄黃有明顯的增效作用，且在抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡方面彰顯優(yōu)勢(shì)[4]。Bcl-2是凋亡分子機(jī)制研究的主要靶分子，是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因，已有研究表明Bcl-2在皮膚鱗癌中廣泛表達(dá)，而p53蛋白的抗腫瘤作用主要是通過(guò)調(diào)控下游基因如p21Waf 1/cip l促使細(xì)胞停止在G1期，讓受損的細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)或發(fā)生凋亡，而無(wú)法進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞的增殖[5-6]。目前，關(guān)于雄黃抗腫瘤作用的文獻(xiàn)研究很多，但是有關(guān)納米雄黃對(duì)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞作用的研究卻較少。

本研究旨在從納米雄黃干預(yù)p53、Bcl-2在人皮膚鱗癌A431細(xì)胞中的表達(dá)切入，進(jìn)一步探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。研究結(jié)果顯示，納米雄黃、DDP及DDP+納米雄黃均能明顯抑制Bcl-2的活性；隨著納米雄黃藥物濃度的升高，Bcl-2陽(yáng)性率也明顯降低，Bcl-2的活性與納米雄黃的濃度成負(fù)性相關(guān)；DDP+納米雄黃對(duì)Bcl-2的抑制作用明顯高于單用納米雄黃或單用DDP，二者聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。納米雄黃、DDP及DDP+納米雄黃均能明顯增加p53的表達(dá)，隨著納米雄黃藥物濃度的升高，p53的RATIO明顯升高，p53的表達(dá)與納米雄黃的給藥濃度成正性相關(guān)；DDP+納米雄黃對(duì)p53表達(dá)的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于單用納米雄黃或單用DDP，可以推斷二者聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。本研究初步揭示納米雄黃可上調(diào)p53表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)，其可能是納米雄黃誘導(dǎo)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

[1] 孫玉紅.皮膚癌的發(fā)病因素調(diào)查分析[J].皮膚病與性病，1990，12(1)：31-34.

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[3] 王文鑫，王曉彥.皮膚鱗狀細(xì)胞癌及基底細(xì)胞癌的治療進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2008，40(11)：1346-1349，1338.

[4] 葉曉川，楊祥良，徐輝碧.納米雄黃研究進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展，2009，21(5)：934-939.

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(本文編輯：習(xí) 沙)

·信息·

南方四省發(fā)布H7N9疫情

1月10日～12日，廣東省衛(wèi)生計(jì)生委、浙江省衛(wèi)生計(jì)生委、江蘇省衛(wèi)生廳、福建省衛(wèi)生計(jì)生委分別發(fā)布人感染H7N9禽流感疫情。 廣東省新增4例人感染H7N9禽流感病例，1例病情危重，3例病情穩(wěn)定或較輕；浙江省新確診5例人感染H7N9禽流感病例，1例死亡，3例病情危重，1例為重癥；江蘇省新增1例人感染H7N9禽流感確診病例，病情穩(wěn)定；福建省確診1例人感染H7N9禽流感病例，患者經(jīng)搶救無(wú)效死亡。

InvestigationoftheeffectandmechanismofrealgarnanoontheexpressionofP53andBcl-2inskinsquamouscellcarcinomaA431cells

QIYuanfu，LIHuijie，YANQin.

DepartmentofOncology，AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shandong，Jinan250011

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of realgar nano on the expression of P53 and Bcl-2 in skin squamous cell carcinoma A431 cells.MethodsThe effect of realgar nano on the expression of P53 and Bcl-2 in skin squamous cell carcinoma A431 cells were observed by cell culture，RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsPositive rate of Bcl-2 in different concentration groups of realgar nano，DDP group and combination drug therapy group was higher than that in control group(P<0.05).Positive rate of Bcl-2 was decreased with the increase of realgar nano concentration(P<0.05).Positive rate of Bcl-2 in combination drug therapy group was lower than that in different concentration groups of realgar nano and DDP group(P<0.05).The mean gray value of p53 in different concentration groups of realgar nano，DDP group and combination drug therapy group was higher than that in control group(P<0.05).The mean gray value of p53 was increased with the increase of realgar nano concentration(P<0.05).The mean gray value of p53 in combination drug therapy group was higher than that in different concentration groups of realgar nano and DDP group(P<0.05).Striped gray in different concentration groups of realgar nano was higher than that in control group(P<0.05).Striped gray in 5%，10% and 20% realgar nano group was increased.Striped gray in combination drug therapy group was higher than that in different concentration groups of realgar nano and DDP group(P<0.05).ConclusionRealgar nano may down regulate the expression of Bcl-2 and has synergistic effect by combination of DDP，one of the mechanisms may be nano realgar-induced human skin squamous cell apoptosis of A431 cells.

Carcinoma；Squamous cell；Skin cancer；Realgar；Pharmacology；Apoptosis

※ 項(xiàng)目來(lái)源：山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：ZR2010HL050)作者簡(jiǎn)介：齊元富(1963—)，男，主任醫(yī)師，教授，博士。從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治研究工作。

R392.11；R730.261；R739.5；R739.502.2；R730.261

A

1002-2619(2014)01-0109-03

2013-01-18)