陳洋

【摘要】 目的 探討如何確立外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)條件， 以獲得良好的制片效果。方法 在已消毒好備用的超凈臺內(nèi)， 用碘伏消毒采血管的頭部， 輕輕混勻后接種， 加入秋水仙素工作液， 經(jīng)混勻、培養(yǎng)、收集細(xì)胞并離心后， 棄上清液， 加入低滲液混勻， 給予預(yù)固定；重復(fù)固定后依細(xì)胞數(shù)量加入適量固定液， 制片、染色、氣干。于低倍鏡下細(xì)致觀察， 計(jì)數(shù)200個分裂相。結(jié)果 細(xì)胞生長良好， 分裂指數(shù)高， 能夠滿足分析要求， 染色體分散均勻， 著色良好， 長短適中， 兩條姐妹染色體大致平行分離， 著絲粒清晰。結(jié)論 尋找適合自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件能提高染色體畸變的檢出率和閱片速度， 及時準(zhǔn)確地反映輻射損傷情況， 對放射工作人員健康進(jìn)行監(jiān)護(hù)， 為意外放射性損傷事故進(jìn)行生物劑量估算， 為放射患者診斷與治療提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 染色體畸變；實(shí)驗(yàn)條件

人體受到一定劑量的電離輻射后， 即可見到染色體的變化， 稱為染色體畸變。染色體畸變分析是放射工作人員健康監(jiān)護(hù)和慢性小劑量受眾遠(yuǎn)期醫(yī)學(xué)效應(yīng)評價的重要指標(biāo)，是最直接反映輻射損傷的檢查項(xiàng)目之一[1， 2]。而細(xì)胞遺傳學(xué)研究的對象是活的細(xì)胞， 其手工操作復(fù)雜、中間環(huán)節(jié)多、培養(yǎng)時間長， 易受各種因素的影響， 故容易導(dǎo)致結(jié)果的偏離。為確保做出需要的合格的染色體涂片， 尋找適合的標(biāo)本制備條件顯得至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)長期的細(xì)胞遺傳學(xué)工作經(jīng)驗(yàn)， 對實(shí)驗(yàn)的方法做如下介紹。

1 材料與方法

1. 1 材料 肝素抗凝外周全血5 ml、RPMI1640培養(yǎng)基、秋水仙素（工作濃度20 μg/ml）、低滲液（為0.075M氯化鉀）、磷酸鹽緩沖液（由濃度均為1/15M的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀以1：1體積比混合， pH值為6.8）。

1. 2 方法 參照染色體畸變估算生物劑量方法（GB/T 28236-2011）及國內(nèi)文獻(xiàn)[3， 4]并結(jié)合作者的實(shí)踐做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

1. 2. 1 接種與培養(yǎng) 在已消毒好備用的超凈臺內(nèi)， 用碘伏消毒采血管的頭部， 將血樣輕輕混勻， 用5 ml注射器取血0.3 ml， 接種到已融化好的培養(yǎng)基中， 同時加入20 μg/ml秋水仙素工作液， 將培養(yǎng)基混勻， 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)50～54 h。

1. 2. 2 收獲 首先收集細(xì)胞， 將培養(yǎng)基倒入10 ml離心管中， 1000 r/min離心6 min。棄上清液， 加入低滲液8 ml， 用滴管輕打混勻， 于溫箱中靜置15 min。預(yù)固定：加入固定液1 ml， 輕輕混勻。以1000 r/min離心6min。固定：棄上清液， 加入固定液8 ml混勻， 靜置20 min， 然后以1000 r/min， 離心6 min。再次固定， 棄上清液， 加入6 ml固定液， 靜置20 min， 然后以1000 r/min， 離心6 min。棄上清后， 依細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液， 約0.2 ml， 備用。

1. 3 制片 取細(xì)胞懸液滴在備用的濕冷玻片上， 在酒精燈上過火， 寫上編號。

1. 4 Giemsa染色 Giemsa染液與磷酸緩沖液制成5%的工作液， 把晾干的載玻片反蓋在上面（細(xì)胞面朝下）， 將制備好的工作液灌滿染色槽， 排出氣泡， 染色20 min后用自來水沖片， 氣干。

1. 5 鏡檢 在低倍鏡下尋找分散良好、長短適中的分裂相， 換用油鏡對其進(jìn)行細(xì)致觀察， 每張片計(jì)數(shù)200個分裂相。

2 結(jié)果

細(xì)胞生長良好， 分裂指數(shù)高， 能夠滿足分析要求， 染色體分散均勻， 著色良好， 長短適中， 兩條姐妹染色體大致平行分離， 著絲粒清晰。根據(jù)每條染色體的大小和著絲粒的位置， 區(qū)分中央著絲粒染色體、亞中央著絲粒染色體和近端著絲粒染色體。健康人的每一體細(xì)胞都含有46 條染色體， 其中有22對是男女共有的， 稱為常染色體， 另外1對則男女相差很大， 稱性染色體。見圖1。

圖1 制備完成的分散良好的染色體

3 討論

培養(yǎng)基和器皿的準(zhǔn)備、采血及血量的要求、秋水仙素的使用、低滲處理以及染色等方面均可決定染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)的成敗， 現(xiàn)做如下的討論。

①培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：培養(yǎng)基在每新?lián)Q批號時應(yīng)先與正在使用的培養(yǎng)基同時做平行樣試驗(yàn)， 確認(rèn)培養(yǎng)細(xì)胞成功后才可以批量使用。②器皿的準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)室所用的載玻片清洗干凈后， 要在鉻酸浸泡24 h后， 洗凈于蒸餾水中浸泡， 放置在冰箱中備用。根據(jù)文獻(xiàn)， 亦有人提出酸、堿性氧化電位水清洗玻璃器皿， 效果肯定， 但制水機(jī)器較昂貴， 需根據(jù)各個實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況決定[5]。③采血及血量要求：一定要注意消毒， 避免污染， 防止培養(yǎng)失敗。在事故現(xiàn)場或到工廠體檢采血， 遇到不能馬上培養(yǎng)的情況， 在運(yùn)輸?shù)倪^程中要注意低溫保存， 又要防止凍結(jié)， 同時盡量避免震動。盡量使用真空采血管采血， 以減少溶血[6]。情況允許盡快進(jìn)行培養(yǎng)。外周血接種培養(yǎng)時， 要加入合適濃度的全血。每5 ml全培養(yǎng)基中加入0.3 ml全血， 如過少， 細(xì)胞數(shù)目少， 最后所得分裂相少；過多， 細(xì)胞數(shù)目過多， 易造成細(xì)胞營養(yǎng)不足死亡[7]。④秋水仙素使用：作者將秋水仙素于接種時即與標(biāo)本混合， 認(rèn)為這樣的好處首先是接觸充分， 利于秋水仙素的作用；其次， 由于秋水仙素具有細(xì)胞毒性， 高濃度其鏡下表現(xiàn)可見細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)固縮， 著色深紫色， 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低[8]， 培養(yǎng)前混入秋水仙素， 可減少秋水仙素的濃度（建議終濃度為0.03 μg/ml）和用量， 即減輕其細(xì)胞毒作用， 是提高實(shí)驗(yàn)效能的關(guān)鍵。⑤低滲處理：是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟， 主要是時間的把握。低滲處理時間過短會造成細(xì)胞破膜膨脹不全， 染色體分散不均， 重疊現(xiàn)象嚴(yán)重， 背景不清晰；而如果是低滲處理時間過長， 會造成染色體薄弱、丟失[9]。作者的經(jīng)驗(yàn)是低滲時間以15 min為宜。低滲后的細(xì)胞易破裂， 所以操作不要過猛。低滲處理是整個實(shí)驗(yàn)過程的關(guān)鍵， 溫度對結(jié)果影響也很大， 如果是室內(nèi)溫度低， 最好將其放置于37℃培養(yǎng)箱中靜置。固定液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。⑥染色與制片：染色直接關(guān)系到制片的好壞， 染液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。另外， 存放玻片的冰箱應(yīng)避免存放酸堿， 酸堿度對制片效果有直接影響。染色的時間也要依滴片的厚薄及染液的濃度做適當(dāng)調(diào)整。

綜上所述， 染色體畸變分析標(biāo)本制備的每個環(huán)節(jié)都很重要， 出現(xiàn)失誤會直接影響最終制片的效果， 增加觀察的難度和檢驗(yàn)結(jié)果的偏差。因此找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件， 并不斷完善和總結(jié)經(jīng)驗(yàn)至關(guān)重要。另外操作規(guī)程只是室內(nèi)質(zhì)控的一部分， 人員的培訓(xùn)， 儀器設(shè)備的規(guī)范管理， 培養(yǎng)基及其他試劑的質(zhì)量控制都很重要。

參考文獻(xiàn)

[1] 李小芳，呂玉民. 放射工作人員外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變和微核分析.河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2006，18（5）：386-388.

[2] 王喜愛，韓林，王平，等.放射工作人員外周血淋巴細(xì)胞微核分析.醫(yī)藥論壇雜志， 2008，29（4）：32.

[3] 肖正華.改良的人體外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)與染色體標(biāo)本的制作技術(shù).第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 1994，16（6）：450.

[4] 侯艷香.人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)染色體制備及影響因素.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2013 ，10（7）：874.

[5] 左向華，陳建魁，金欣 ，等.酸、堿性氧化電位水替代硫酸洗液的實(shí)驗(yàn)研究.中國醫(yī)藥導(dǎo)報， 2007，4（22）：35，41.

[6] 杜伙芬.不同靜脈采血方法對血液標(biāo)本溶血的影響研究.中外醫(yī)學(xué)研究， 2013，11 （23）：89.

[7] 任莉萍，李娟，潘亞麗， 等.人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制作技術(shù).生物學(xué)通報， 2011，46（3）：54.

[8] Ranney DF. Suppression of stimulating cell activity by microtubule-disrupting alkaloids. ournal of supramolecular structure， 1976，5（3）： 335-342.

[9] 傅松濱.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué).北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社， 2009：63-84.

[收稿日期：2014-04-10]endprint

【摘要】 目的 探討如何確立外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)條件， 以獲得良好的制片效果。方法 在已消毒好備用的超凈臺內(nèi)， 用碘伏消毒采血管的頭部， 輕輕混勻后接種， 加入秋水仙素工作液， 經(jīng)混勻、培養(yǎng)、收集細(xì)胞并離心后， 棄上清液， 加入低滲液混勻， 給予預(yù)固定；重復(fù)固定后依細(xì)胞數(shù)量加入適量固定液， 制片、染色、氣干。于低倍鏡下細(xì)致觀察， 計(jì)數(shù)200個分裂相。結(jié)果 細(xì)胞生長良好， 分裂指數(shù)高， 能夠滿足分析要求， 染色體分散均勻， 著色良好， 長短適中， 兩條姐妹染色體大致平行分離， 著絲粒清晰。結(jié)論 尋找適合自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件能提高染色體畸變的檢出率和閱片速度， 及時準(zhǔn)確地反映輻射損傷情況， 對放射工作人員健康進(jìn)行監(jiān)護(hù)， 為意外放射性損傷事故進(jìn)行生物劑量估算， 為放射患者診斷與治療提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 染色體畸變；實(shí)驗(yàn)條件

人體受到一定劑量的電離輻射后， 即可見到染色體的變化， 稱為染色體畸變。染色體畸變分析是放射工作人員健康監(jiān)護(hù)和慢性小劑量受眾遠(yuǎn)期醫(yī)學(xué)效應(yīng)評價的重要指標(biāo)，是最直接反映輻射損傷的檢查項(xiàng)目之一[1， 2]。而細(xì)胞遺傳學(xué)研究的對象是活的細(xì)胞， 其手工操作復(fù)雜、中間環(huán)節(jié)多、培養(yǎng)時間長， 易受各種因素的影響， 故容易導(dǎo)致結(jié)果的偏離。為確保做出需要的合格的染色體涂片， 尋找適合的標(biāo)本制備條件顯得至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)長期的細(xì)胞遺傳學(xué)工作經(jīng)驗(yàn)， 對實(shí)驗(yàn)的方法做如下介紹。

1 材料與方法

1. 1 材料 肝素抗凝外周全血5 ml、RPMI1640培養(yǎng)基、秋水仙素（工作濃度20 μg/ml）、低滲液（為0.075M氯化鉀）、磷酸鹽緩沖液（由濃度均為1/15M的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀以1：1體積比混合， pH值為6.8）。

1. 2 方法 參照染色體畸變估算生物劑量方法（GB/T 28236-2011）及國內(nèi)文獻(xiàn)[3， 4]并結(jié)合作者的實(shí)踐做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

1. 2. 1 接種與培養(yǎng) 在已消毒好備用的超凈臺內(nèi)， 用碘伏消毒采血管的頭部， 將血樣輕輕混勻， 用5 ml注射器取血0.3 ml， 接種到已融化好的培養(yǎng)基中， 同時加入20 μg/ml秋水仙素工作液， 將培養(yǎng)基混勻， 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)50～54 h。

1. 2. 2 收獲 首先收集細(xì)胞， 將培養(yǎng)基倒入10 ml離心管中， 1000 r/min離心6 min。棄上清液， 加入低滲液8 ml， 用滴管輕打混勻， 于溫箱中靜置15 min。預(yù)固定：加入固定液1 ml， 輕輕混勻。以1000 r/min離心6min。固定：棄上清液， 加入固定液8 ml混勻， 靜置20 min， 然后以1000 r/min， 離心6 min。再次固定， 棄上清液， 加入6 ml固定液， 靜置20 min， 然后以1000 r/min， 離心6 min。棄上清后， 依細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液， 約0.2 ml， 備用。

1. 3 制片 取細(xì)胞懸液滴在備用的濕冷玻片上， 在酒精燈上過火， 寫上編號。

1. 4 Giemsa染色 Giemsa染液與磷酸緩沖液制成5%的工作液， 把晾干的載玻片反蓋在上面（細(xì)胞面朝下）， 將制備好的工作液灌滿染色槽， 排出氣泡， 染色20 min后用自來水沖片， 氣干。

1. 5 鏡檢 在低倍鏡下尋找分散良好、長短適中的分裂相， 換用油鏡對其進(jìn)行細(xì)致觀察， 每張片計(jì)數(shù)200個分裂相。

2 結(jié)果

細(xì)胞生長良好， 分裂指數(shù)高， 能夠滿足分析要求， 染色體分散均勻， 著色良好， 長短適中， 兩條姐妹染色體大致平行分離， 著絲粒清晰。根據(jù)每條染色體的大小和著絲粒的位置， 區(qū)分中央著絲粒染色體、亞中央著絲粒染色體和近端著絲粒染色體。健康人的每一體細(xì)胞都含有46 條染色體， 其中有22對是男女共有的， 稱為常染色體， 另外1對則男女相差很大， 稱性染色體。見圖1。

圖1 制備完成的分散良好的染色體

3 討論

培養(yǎng)基和器皿的準(zhǔn)備、采血及血量的要求、秋水仙素的使用、低滲處理以及染色等方面均可決定染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)的成敗， 現(xiàn)做如下的討論。

①培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：培養(yǎng)基在每新?lián)Q批號時應(yīng)先與正在使用的培養(yǎng)基同時做平行樣試驗(yàn)， 確認(rèn)培養(yǎng)細(xì)胞成功后才可以批量使用。②器皿的準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)室所用的載玻片清洗干凈后， 要在鉻酸浸泡24 h后， 洗凈于蒸餾水中浸泡， 放置在冰箱中備用。根據(jù)文獻(xiàn)， 亦有人提出酸、堿性氧化電位水清洗玻璃器皿， 效果肯定， 但制水機(jī)器較昂貴， 需根據(jù)各個實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況決定[5]。③采血及血量要求：一定要注意消毒， 避免污染， 防止培養(yǎng)失敗。在事故現(xiàn)場或到工廠體檢采血， 遇到不能馬上培養(yǎng)的情況， 在運(yùn)輸?shù)倪^程中要注意低溫保存， 又要防止凍結(jié)， 同時盡量避免震動。盡量使用真空采血管采血， 以減少溶血[6]。情況允許盡快進(jìn)行培養(yǎng)。外周血接種培養(yǎng)時， 要加入合適濃度的全血。每5 ml全培養(yǎng)基中加入0.3 ml全血， 如過少， 細(xì)胞數(shù)目少， 最后所得分裂相少；過多， 細(xì)胞數(shù)目過多， 易造成細(xì)胞營養(yǎng)不足死亡[7]。④秋水仙素使用：作者將秋水仙素于接種時即與標(biāo)本混合， 認(rèn)為這樣的好處首先是接觸充分， 利于秋水仙素的作用；其次， 由于秋水仙素具有細(xì)胞毒性， 高濃度其鏡下表現(xiàn)可見細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)固縮， 著色深紫色， 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低[8]， 培養(yǎng)前混入秋水仙素， 可減少秋水仙素的濃度（建議終濃度為0.03 μg/ml）和用量， 即減輕其細(xì)胞毒作用， 是提高實(shí)驗(yàn)效能的關(guān)鍵。⑤低滲處理：是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟， 主要是時間的把握。低滲處理時間過短會造成細(xì)胞破膜膨脹不全， 染色體分散不均， 重疊現(xiàn)象嚴(yán)重， 背景不清晰；而如果是低滲處理時間過長， 會造成染色體薄弱、丟失[9]。作者的經(jīng)驗(yàn)是低滲時間以15 min為宜。低滲后的細(xì)胞易破裂， 所以操作不要過猛。低滲處理是整個實(shí)驗(yàn)過程的關(guān)鍵， 溫度對結(jié)果影響也很大， 如果是室內(nèi)溫度低， 最好將其放置于37℃培養(yǎng)箱中靜置。固定液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。⑥染色與制片：染色直接關(guān)系到制片的好壞， 染液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。另外， 存放玻片的冰箱應(yīng)避免存放酸堿， 酸堿度對制片效果有直接影響。染色的時間也要依滴片的厚薄及染液的濃度做適當(dāng)調(diào)整。

綜上所述， 染色體畸變分析標(biāo)本制備的每個環(huán)節(jié)都很重要， 出現(xiàn)失誤會直接影響最終制片的效果， 增加觀察的難度和檢驗(yàn)結(jié)果的偏差。因此找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件， 并不斷完善和總結(jié)經(jīng)驗(yàn)至關(guān)重要。另外操作規(guī)程只是室內(nèi)質(zhì)控的一部分， 人員的培訓(xùn)， 儀器設(shè)備的規(guī)范管理， 培養(yǎng)基及其他試劑的質(zhì)量控制都很重要。

參考文獻(xiàn)

[1] 李小芳，呂玉民. 放射工作人員外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變和微核分析.河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2006，18（5）：386-388.

[2] 王喜愛，韓林，王平，等.放射工作人員外周血淋巴細(xì)胞微核分析.醫(yī)藥論壇雜志， 2008，29（4）：32.

[3] 肖正華.改良的人體外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)與染色體標(biāo)本的制作技術(shù).第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 1994，16（6）：450.

[4] 侯艷香.人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)染色體制備及影響因素.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2013 ，10（7）：874.

[5] 左向華，陳建魁，金欣 ，等.酸、堿性氧化電位水替代硫酸洗液的實(shí)驗(yàn)研究.中國醫(yī)藥導(dǎo)報， 2007，4（22）：35，41.

[6] 杜伙芬.不同靜脈采血方法對血液標(biāo)本溶血的影響研究.中外醫(yī)學(xué)研究， 2013，11 （23）：89.

[7] 任莉萍，李娟，潘亞麗， 等.人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制作技術(shù).生物學(xué)通報， 2011，46（3）：54.

[8] Ranney DF. Suppression of stimulating cell activity by microtubule-disrupting alkaloids. ournal of supramolecular structure， 1976，5（3）： 335-342.

[9] 傅松濱.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué).北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社， 2009：63-84.

[收稿日期：2014-04-10]endprint

【摘要】 目的 探討如何確立外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)條件， 以獲得良好的制片效果。方法 在已消毒好備用的超凈臺內(nèi)， 用碘伏消毒采血管的頭部， 輕輕混勻后接種， 加入秋水仙素工作液， 經(jīng)混勻、培養(yǎng)、收集細(xì)胞并離心后， 棄上清液， 加入低滲液混勻， 給予預(yù)固定；重復(fù)固定后依細(xì)胞數(shù)量加入適量固定液， 制片、染色、氣干。于低倍鏡下細(xì)致觀察， 計(jì)數(shù)200個分裂相。結(jié)果 細(xì)胞生長良好， 分裂指數(shù)高， 能夠滿足分析要求， 染色體分散均勻， 著色良好， 長短適中， 兩條姐妹染色體大致平行分離， 著絲粒清晰。結(jié)論 尋找適合自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件能提高染色體畸變的檢出率和閱片速度， 及時準(zhǔn)確地反映輻射損傷情況， 對放射工作人員健康進(jìn)行監(jiān)護(hù)， 為意外放射性損傷事故進(jìn)行生物劑量估算， 為放射患者診斷與治療提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 染色體畸變；實(shí)驗(yàn)條件

人體受到一定劑量的電離輻射后， 即可見到染色體的變化， 稱為染色體畸變。染色體畸變分析是放射工作人員健康監(jiān)護(hù)和慢性小劑量受眾遠(yuǎn)期醫(yī)學(xué)效應(yīng)評價的重要指標(biāo)，是最直接反映輻射損傷的檢查項(xiàng)目之一[1， 2]。而細(xì)胞遺傳學(xué)研究的對象是活的細(xì)胞， 其手工操作復(fù)雜、中間環(huán)節(jié)多、培養(yǎng)時間長， 易受各種因素的影響， 故容易導(dǎo)致結(jié)果的偏離。為確保做出需要的合格的染色體涂片， 尋找適合的標(biāo)本制備條件顯得至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)長期的細(xì)胞遺傳學(xué)工作經(jīng)驗(yàn)， 對實(shí)驗(yàn)的方法做如下介紹。

1 材料與方法

1. 1 材料 肝素抗凝外周全血5 ml、RPMI1640培養(yǎng)基、秋水仙素（工作濃度20 μg/ml）、低滲液（為0.075M氯化鉀）、磷酸鹽緩沖液（由濃度均為1/15M的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀以1：1體積比混合， pH值為6.8）。

1. 2 方法 參照染色體畸變估算生物劑量方法（GB/T 28236-2011）及國內(nèi)文獻(xiàn)[3， 4]并結(jié)合作者的實(shí)踐做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

1. 2. 1 接種與培養(yǎng) 在已消毒好備用的超凈臺內(nèi)， 用碘伏消毒采血管的頭部， 將血樣輕輕混勻， 用5 ml注射器取血0.3 ml， 接種到已融化好的培養(yǎng)基中， 同時加入20 μg/ml秋水仙素工作液， 將培養(yǎng)基混勻， 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)50～54 h。

1. 2. 2 收獲 首先收集細(xì)胞， 將培養(yǎng)基倒入10 ml離心管中， 1000 r/min離心6 min。棄上清液， 加入低滲液8 ml， 用滴管輕打混勻， 于溫箱中靜置15 min。預(yù)固定：加入固定液1 ml， 輕輕混勻。以1000 r/min離心6min。固定：棄上清液， 加入固定液8 ml混勻， 靜置20 min， 然后以1000 r/min， 離心6 min。再次固定， 棄上清液， 加入6 ml固定液， 靜置20 min， 然后以1000 r/min， 離心6 min。棄上清后， 依細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液， 約0.2 ml， 備用。

1. 3 制片 取細(xì)胞懸液滴在備用的濕冷玻片上， 在酒精燈上過火， 寫上編號。

1. 4 Giemsa染色 Giemsa染液與磷酸緩沖液制成5%的工作液， 把晾干的載玻片反蓋在上面（細(xì)胞面朝下）， 將制備好的工作液灌滿染色槽， 排出氣泡， 染色20 min后用自來水沖片， 氣干。

1. 5 鏡檢 在低倍鏡下尋找分散良好、長短適中的分裂相， 換用油鏡對其進(jìn)行細(xì)致觀察， 每張片計(jì)數(shù)200個分裂相。

2 結(jié)果

細(xì)胞生長良好， 分裂指數(shù)高， 能夠滿足分析要求， 染色體分散均勻， 著色良好， 長短適中， 兩條姐妹染色體大致平行分離， 著絲粒清晰。根據(jù)每條染色體的大小和著絲粒的位置， 區(qū)分中央著絲粒染色體、亞中央著絲粒染色體和近端著絲粒染色體。健康人的每一體細(xì)胞都含有46 條染色體， 其中有22對是男女共有的， 稱為常染色體， 另外1對則男女相差很大， 稱性染色體。見圖1。

圖1 制備完成的分散良好的染色體

3 討論

培養(yǎng)基和器皿的準(zhǔn)備、采血及血量的要求、秋水仙素的使用、低滲處理以及染色等方面均可決定染色體畸變分析實(shí)驗(yàn)的成敗， 現(xiàn)做如下的討論。

①培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：培養(yǎng)基在每新?lián)Q批號時應(yīng)先與正在使用的培養(yǎng)基同時做平行樣試驗(yàn)， 確認(rèn)培養(yǎng)細(xì)胞成功后才可以批量使用。②器皿的準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)室所用的載玻片清洗干凈后， 要在鉻酸浸泡24 h后， 洗凈于蒸餾水中浸泡， 放置在冰箱中備用。根據(jù)文獻(xiàn)， 亦有人提出酸、堿性氧化電位水清洗玻璃器皿， 效果肯定， 但制水機(jī)器較昂貴， 需根據(jù)各個實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況決定[5]。③采血及血量要求：一定要注意消毒， 避免污染， 防止培養(yǎng)失敗。在事故現(xiàn)場或到工廠體檢采血， 遇到不能馬上培養(yǎng)的情況， 在運(yùn)輸?shù)倪^程中要注意低溫保存， 又要防止凍結(jié)， 同時盡量避免震動。盡量使用真空采血管采血， 以減少溶血[6]。情況允許盡快進(jìn)行培養(yǎng)。外周血接種培養(yǎng)時， 要加入合適濃度的全血。每5 ml全培養(yǎng)基中加入0.3 ml全血， 如過少， 細(xì)胞數(shù)目少， 最后所得分裂相少；過多， 細(xì)胞數(shù)目過多， 易造成細(xì)胞營養(yǎng)不足死亡[7]。④秋水仙素使用：作者將秋水仙素于接種時即與標(biāo)本混合， 認(rèn)為這樣的好處首先是接觸充分， 利于秋水仙素的作用；其次， 由于秋水仙素具有細(xì)胞毒性， 高濃度其鏡下表現(xiàn)可見細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)固縮， 著色深紫色， 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低[8]， 培養(yǎng)前混入秋水仙素， 可減少秋水仙素的濃度（建議終濃度為0.03 μg/ml）和用量， 即減輕其細(xì)胞毒作用， 是提高實(shí)驗(yàn)效能的關(guān)鍵。⑤低滲處理：是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟， 主要是時間的把握。低滲處理時間過短會造成細(xì)胞破膜膨脹不全， 染色體分散不均， 重疊現(xiàn)象嚴(yán)重， 背景不清晰；而如果是低滲處理時間過長， 會造成染色體薄弱、丟失[9]。作者的經(jīng)驗(yàn)是低滲時間以15 min為宜。低滲后的細(xì)胞易破裂， 所以操作不要過猛。低滲處理是整個實(shí)驗(yàn)過程的關(guān)鍵， 溫度對結(jié)果影響也很大， 如果是室內(nèi)溫度低， 最好將其放置于37℃培養(yǎng)箱中靜置。固定液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。⑥染色與制片：染色直接關(guān)系到制片的好壞， 染液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。另外， 存放玻片的冰箱應(yīng)避免存放酸堿， 酸堿度對制片效果有直接影響。染色的時間也要依滴片的厚薄及染液的濃度做適當(dāng)調(diào)整。

綜上所述， 染色體畸變分析標(biāo)本制備的每個環(huán)節(jié)都很重要， 出現(xiàn)失誤會直接影響最終制片的效果， 增加觀察的難度和檢驗(yàn)結(jié)果的偏差。因此找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件， 并不斷完善和總結(jié)經(jīng)驗(yàn)至關(guān)重要。另外操作規(guī)程只是室內(nèi)質(zhì)控的一部分， 人員的培訓(xùn)， 儀器設(shè)備的規(guī)范管理， 培養(yǎng)基及其他試劑的質(zhì)量控制都很重要。

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[收稿日期：2014-04-10]endprint