★ 劉丹卓 趙新廣 尤昭玲 左之文

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南 長沙 410007；2.株洲千金藥業(yè)股份有限公司 湖南 株洲 412003)

婦科千金膠囊是湖南株洲千金藥業(yè)股份有限公司在婦科千金片基礎(chǔ)上研制的中藥四類新藥，是國家醫(yī)保甲類品種，國家計(jì)委重點(diǎn)支持中藥，是目前用于治療女性生殖器官炎癥的知名品牌，臨床療效確切，市場前景良好。婦科千金膠囊作為千金藥業(yè)的拳頭產(chǎn)品，其用藥安全性，目前僅有對(duì)其急毒、長毒評(píng)價(jià)方面資料。用藥說明雖有孕婦禁用，但缺乏可信的禁用依據(jù)。有效評(píng)價(jià)藥物對(duì)女性生殖功能的影響有著深遠(yuǎn)的意義，女性生殖系統(tǒng)是藥物作用的一個(gè)特有的靶器官，女性生殖系統(tǒng)復(fù)雜且所有配子在出生前就已形成,所以其損害可能是多靶點(diǎn)及永久性的,并可導(dǎo)致完全絕育[1]。有鑒于此，本文通過其不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞株體外染毒，進(jìn)行遺傳毒性測定,以期獲得其繼藥效學(xué)之后的臨床前毒效學(xué)資料，為其對(duì)育齡婦女特殊期(種子期、妊娠期、哺乳期)合理和安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)，并為構(gòu)建和諧醫(yī)患關(guān)系，走入國際市場提供必要的臨床前安全性資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試物 婦科千金膠囊由湖南株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：20071226，含量或純度：8.33g生藥/g膠溶物，理化性質(zhì)：溶于水(384mg膠溶物/mL)。室溫20℃避光保存，臨用時(shí)取膠溶物用雙蒸餾水配成所需濃度的混懸液。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)由中國藥品生物制品鑒定所提供，由液氮冷凍保存。采用細(xì)胞培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)液補(bǔ)加10%胎牛血清，在370C、5%CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑與儀器 HAM F12培養(yǎng)基：GIBCO公司；胎牛血清：北京元亨金馬；DMSO：北京化學(xué)試劑公司；天平：瑞士METTLER TOLEDO AL204DU-IC型；生物安全柜：美國Labconco DELTA型；恒溫?fù)u床：上海智城ZHWY-200B型。

1.1.4 陽性對(duì)照劑 間接誘變劑為環(huán)磷酰胺(Cyclophosphomide)，代號(hào)CP，來源于上海華聯(lián)制藥有限公司/011204，外觀為白色粉劑，用生理鹽水配制成20mg/mL-1母液，現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋成50ug/mL-1應(yīng)用液。直接誘變劑為絲裂霉素C(Mitomycin C),代號(hào)MMC，來源于Kyowa Hakko Kogyo Co.ltd/333AJG。外觀為灰色粉劑，用生理鹽水配制成200ug/mL-1母液，現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋成25ug/mL-1應(yīng)用液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法[1-5]

1.2.1 S9活化系統(tǒng)制備 取體重在160～200g健康Sprague-Dawley SPF/VAF雌性大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2007-0001。腹腔注射多氯聯(lián)苯玉米油溶液(200mg/mL-1)，注射劑量為500mg/kg-1，5d后頸椎脫臼處死大鼠，制備肝勻漿。9 000g離心10min,取上清液(S9)分裝，液氮冷凍保存；臨用時(shí)，取S9進(jìn)行S9混合液配制。S9混合液組成(mL)：0.1mLS9、8u molMgCL2、33u molKCL、5u molG-6-P、4u molNADP、0.5mL磷酸緩沖液(PH7.4)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)采用MTT方法觀察婦科千金膠囊不同濃度對(duì)CHL細(xì)胞生長的抑制作用結(jié)果，設(shè)3個(gè)劑量組濃度分別為5 000、2 500、1 250μg/mL。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照、S9對(duì)照及陽性誘變劑對(duì)照。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)操作步驟及檢測指標(biāo) (1)取處于對(duì)數(shù)生長期的CHL細(xì)胞培養(yǎng)體系，正常對(duì)照或3個(gè)劑量組分別加入相應(yīng)劑量的應(yīng)用液，加樣體積均為40μL，陽性對(duì)照按照各自的濃度要求加入適當(dāng)體積的溶液。其中，在-S9mix的條件下，不同濃度藥物的作用時(shí)間各取兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即24h和48h；+S9mix時(shí)藥物作用于細(xì)胞的時(shí)間為6h，然后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h。(2)終止培養(yǎng)前2h秋水仙堿處理；0.25%胰蛋白酶液消化;離心管離心;低滲液低滲;固定液固定;離心,重復(fù)1次；滴片，酒精燈上干燥；10%Giemsa染色制片。(3)指標(biāo)檢測，每個(gè)濃度組至少觀察100個(gè)中期分裂相，在油鏡下分別記錄細(xì)胞染色體的數(shù)量變化及畸變類型，然后根據(jù)畸變細(xì)胞數(shù)算得畸變率。結(jié)構(gòu)畸變包括染色體型畸變和染色單體畸變，畸變類型包括斷裂、缺失、易位、雙著絲點(diǎn)和環(huán)等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 9.13版軟件由計(jì)算機(jī)完成，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 婦科千金膠囊不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變影響I 直接誘變劑絲裂霉素C(MMC)在25ug/mL濃度下,CHL細(xì)胞染色體畸變率顯著增高至60%，而溶劑對(duì)照組在-S9測試系統(tǒng)條件下,染色體結(jié)構(gòu)畸變率為1%，陽性對(duì)照組與溶劑對(duì)照組比較差異非常顯著(P<0.01)。婦科千金膠囊各不同劑量組，在S9非活化測試系統(tǒng)條件下，無論24h或48h收獲CHL細(xì)胞，進(jìn)行染色體畸變分析，染色體畸變率均在正常范圍，并與溶劑對(duì)照比較無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 婦科千金膠囊不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變影響1

2.2 婦科千金膠囊不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變影響II 間接誘變劑環(huán)磷酰胺(CP)在50ug/mL濃度下，在S9活化條件下染色體畸變率顯著增高至70%，而溶劑對(duì)照組在+S9測試系統(tǒng)條件下,染色體結(jié)構(gòu)畸變率為1%，陽性對(duì)照與溶劑對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加(P<0.01)。婦科千金膠囊各不同劑量組，在S9活化測試系統(tǒng)條件下，無論24h或48h收獲CHL細(xì)胞，進(jìn)行染色體畸變分析，染色體畸變率均在正常范圍，并與溶劑對(duì)照比較無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 婦科千金膠囊不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變影響2

3 討論

染色體是一條雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA鏈和比較松散地結(jié)合在蛋白質(zhì)上的復(fù)合物。它是遺傳單位基因的載體，具有獨(dú)特的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，當(dāng)受到外界誘變物作用時(shí)易出現(xiàn)損傷，即在形態(tài)及結(jié)構(gòu)上發(fā)生畸變。染色體畸變的機(jī)制比較復(fù)雜，一般認(rèn)為，誘變物主要作用于細(xì)胞分裂周期G1期，此時(shí)染色體尚未復(fù)制，易致染色體損傷產(chǎn)生畸變。由于CHL細(xì)胞株的不同世代之間，在細(xì)胞周期時(shí)間和克隆形成率等參數(shù)上沒有明顯差異，便于控制實(shí)驗(yàn)條件，且不受動(dòng)物體內(nèi)營養(yǎng)及生理、免疫狀態(tài)影響，因而能定量研究，重復(fù)性也好，且能傳代保存，便于進(jìn)行形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)等觀察，并進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)、生物化學(xué)等分析。CHL染色體畸變?cè)囼?yàn)是體外細(xì)胞培養(yǎng)染色體正向突變實(shí)驗(yàn)[6]，不但能判定染色體數(shù)目異常，尚能判定染色體結(jié)構(gòu)變化。本文采用CHL細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接誘變劑MMC在-S9條件下,CHL細(xì)胞染色體畸變率顯著增高至60%，間接誘變劑CP在+S9條件下染色體畸變率顯著增高至70%，而溶劑對(duì)照在+S9及-S9兩種測試條件下,染色體結(jié)構(gòu)畸變率均小于5%，且陽性對(duì)照與溶劑對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加(P<0.01)，這說明試驗(yàn)系統(tǒng)可信。婦科千金膠囊設(shè)5 000、2 500、1 250μg/mL不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞進(jìn)行體外染毒，結(jié)果無論24h及48h收集細(xì)胞，并在S9活化與非活化兩種測試條件下，進(jìn)行染色體畸變分析，各劑量組、溶劑對(duì)照染色體畸變率均在正常范圍，說明其在本實(shí)驗(yàn)所確定的5000μg/mL內(nèi)，初步認(rèn)為無誘發(fā)CHL染色體畸變作用。

[1]劉育谷.衛(wèi)生毒理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.新藥(中藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編(藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué))，1993.

[3]王治喬.新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997.

[4]王心如.毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[5]李勇，張?zhí)鞂?發(fā)育毒理學(xué)研究方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2000.

[6]Glart H, Bartsch L, Czich A, et a1.Salmonella strains and mammalian cells genetically engineered for expression of sulfotrans-ferases[J].Toxicol Lett，2004，82/83：829-834.